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Universit� de Montr�al

Universit� de Montr�al

Etude des propri�t�s physicochimiques des vecteurs nanoparticulaires

par Xavier Banquy

Facult� de Pharmacie

Th�se pr�sent�e � la Facult� de pharmacie en vue de l’obtention du grade de Philosophi� Doctor (Ph.D.) en Sciences Pharmaceutiques

Juin 2009

� Banquy Xavier, 2009

Universit� de Montr�al Facult� de Pharmacie

Cette th�se intitul�e :

Etude des propri�t�s physico-chimiques des vecteurs nanoparticulaires

Pr�sent�e par Xavier Banquy

a �t� �valu�e par le jury compos� des personnes suivantes :

Pr�sident rapporteur : Fahima Nekka Directrice de recherche : Suzanne Giasson Co-directeur de recherche : Patrice Hildgen Membre du Jury : Antonella Badia Examinateur externe : J�r�me Claverie Repr�sentant du doyen de la FES : Normand Mousseau

i

R�SUM�

Cette th�se rapporte l’�tude des propri�t�s physicochimiques des nanoparticles polym�riques et leur impact sur l’interaction avec les cellules vivantes. Nous nous sommes tout sp�cialement attach�s � �tudier l’effet des propri�t�s adh�sives et m�caniques des nanoparticules sur leur capacit� de p�n�tration de la membrane cellulaire. Pour ce faire, nous avons tout d’abord utilis� des nanoparticules d’acide polylactique (PLA) fonctionnalis�es en surface avec un ligand des s�lectines E et P. Le greffage du ligand sur la particule s’est fait par une nouvelle m�thode exp�rimentale garantissant la pr�sence du ligand � la surface de la particule durant toute sa dur�e de vie. Cette m�thode consiste � m�langer un polym�re fonctionnalis� avec le ligand avec un autre polym�re non fonctionnalis�. La pr�sence du ligand � la surface des nanoparticules form�es � partir de ce m�lange de polym�res a �t� confirm�e par analyse ToF SIMS. Nous avons pu prouver que les particules poss�dant le ligand greff� � leur surface d�montraient une capacit� adh�sive sup�rieure � leurs homologues non fonctionnalis�s sur des cellules endoth�liales HUVEC activ�es par diff�rentes drogues. De plus, le captage des particules par les cellules HUVEC est modul� par le niveau d’expression des r�cepteurs selectine E et P et aussi par la quantit� de ligand libre. Ces r�sultats montrent clairement que le greffage du ligand conf�re aux particules des propri�t�s adh�sives accrues et sp�cifiques ce qui permet leur usage post�rieure comme vecteur pharmaceutique capable de cibler un r�cepteur particulier � la surface d’une cellule. Nous avons aussi d�montr� que l’interaction entre les nanoparticules et la membrane cellulaire peut aussi �tre contr�l�e aussi bien par les propri�t�s m�caniques de la cellule que de la nanoparticule. Dans une premi�re �tape, nous avons mesur� � l’aide de l’appareil de forces de surface l’�lasticit� de cellules macrophagiques d�pos�es sur diff�rents substrats. En contr�lant l’interaction entre la cellule et le substrat sur lequel elle repose nous avons montr� qu’il �tait possible de modifier �

ii volont� les propri�t�s m�caniques cellulaire. Une augmentation de l’�lasticit� cellulaire s’accompagne d’une augmentation syst�matique de l’internalisation de nanoparticules de PLA non fonctionnalis�es. Ceci sugg�re un r�le pr�pond�rant des propri�t�s m�caniques du cortex cellulaire dans le captage des nanoparticules de PLA. Dans une seconde �tape, nous avons �tudi� l’effet des propri�t�s m�caniques des nanoparticules sur leur capacit� de p�n�tration cellulaire. Pour ce faire, nous avons synth�tis� des particules d’hydrogel dont l’�lasticit� �tait contr�l�e par le degr� d’agent r�ticulant inclus dans leur formulation. Le contr�le des propri�t�s m�caniques des nanoparticules a �t� confirm� par la mesure du module de Young des particules par microscopie de force atomique. L’impact des propri�t�s m�caniques de ces particules sur leur capacit� de p�n�tration dans les cellules vivantes a �t� �tudi� sur des cellules macrophagiques de souris. Les r�sultats ont montr� que la cin�tique d’internalisation, la quantit� de particules internalis�es et le m�canisme d’internalisation d�pendent tous du module de Young des nanoparticules. Aucune diff�rence dans le trajet intracellulaire des particules n’a pu �tre observ�e malgr� le fait que diff�rentes voies d’internalisation aient �t� observ�es. Ce dernier r�sultat peut s’expliquer par le fait que les nanoparticules sont internalis�es par plusieurs voie simultan�ment ce qui facilite leur accumulation dans les organelles digestives intracellulaires. Un mod�le simple permettant d’expliquer ces r�sultats a �t� propos� et discut�.

MOTS CLES : nanoparticules, PLA, hydrogel, �lasticit�, selectine, SFA, AFM, interactions, internalisation.

iii

ABSTRACT

This thesis reports the study of physical chemical properties of polymeric nanoparticles and their impact on the interaction with living cells. In particular we endeavoured to study the effect of the adhesive and mechanical properties of the vector on its capacity of penetration of the cellular membrane. With this intention, we firstly used nanoparticules of polylactic acid (PLA) functionalized on their surfaces with a ligand of the selectines E and P receptor. The grafting of the ligand on the particle’s surface was carried out thanks to a new experimental method guaranteeing the presence of the active molecule on the surface of the particle during its whole life cycle. This method consists in mixing a polymer functionalized with the ligand with another polymer not functionalized. The presence of the ligand on the surface of the nanoparticules formed starting from this mixture of polymers was confirmed by ToF SIMS analysis. We could show that the particles having the ligand grafted on their surface exhibit a higher adhesive capacity than their non-functionalized counterpart on endothelial cells HUVEC activated by various drugs. Nanoparticles adhesion on cells membrane was modulated by the level of expression of the receptors selectine E and P and also by the quantity of free ligand. These results show clearly that the functionalized particles possess all the characteristics of a pharmaceutical vector capable of targeting a particular receptor on a cell surface. The interaction between nanoparticules and cellular membrane can also be controlled by the mechanical properties of the cell as well as of the nanoparticule. To demonstrate it we have measured the elasticity of macrophagic cells deposited on various substrates using the SFA. We have thus showed that it was possible to control the cell mechanical properties at will by controlling the interaction between the cell and the substrate on which it rests. An increase of the cell elasticity is accompanied by an increase of the internalization of non-functionalized PLA nanoparticules. This suggests a major role of cytocortical mechanical properties in the capture of hard PLA particles.

iv Lastly, we studied the effect of the mechanical properties of the nanoparticules on their cellular penetration capacity. With this intention, we synthesized hydrogel particles whose elasticity was controlled by the degree of crosslinking agent included in their formulation. The control of the mechanical properties of the nanoparticules was confirmed by the measurement of the Young modulus of the particles by AFM. The interaction of these particles with macrophagess showed that the mechanical properties of the particles affect various aspects related to the internalization of the nanoparticles. The internalization kinetics, the quantity of internalized particles and the mechanism of internalization depend all on the Young modulus of the nanoparticules. No differences in the intracellular pathway could be observed in spite of the fact that various pathways of internalization were observed for these nanoparticules. This last result can be explained by the fact that the nanoparticules are internalized by several mechanisms of simultaneously which facilitates their accumulation in intracellular digestive organelles. A simple model explaining these results is proposed and discussed. KEY WORDS: nanoparticules, PLA, hydrogel, elasticity, selectine, SFA, AFM, interactions, internalization.

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REMERCIEMENTS

Je souhaite tout d’abord remercier mon directeur de recherche, Suzanne Giasson, pour m’avoir accueilli dans son laboratoire. Je voudrais lui exprimer toute ma reconnaissance pour la confiance qu’elle a su m’accorder en me laissant mener mon projet avec une totale libert�. Je voudrais �galement remercier toutes les personnes qui font ou faisaient partie de son groupe de recherche : Frank pour m’avoir transmis ses connaissances techniques, Beno�t pour m’avoir aider dans mon travail de recherche, B�atrice Lego pour ses aides mat�rielles et techniques ainsi que Mohan pour ses le�ons d’anglais. J’aimerais �galement exprimer toute ma gratitude aux professeurs Robert Prud’homme et Julian Zhu pour m’avoir permis d’utiliser les instruments scientifiques de leur laboratoire. Je remercie aussi leurs groupes de recherche respectifs pour leurs disponibilit�s et la formation sur les appareils scientifiques. Je remercie �galement tous les techniciens de l’atelier m�canique pour les nombreuses heures pass�es � la construction et aux r�glages des appareils n�cessaires au bon d�roulement de ce projet. Merci � ma famille pour avoir �t� pr�sente � mes c�t�s durant tout ce parcours. En particulier � mon p�re pour m’avoir transmis son go�t pour les sciences et � ma femme pour son soutien et son amour. A vous tous, merci.

vi

TABLE DES MATIERES

RESUME....................................................................................................................... i ABSTRACT ............................................................................................................... iii REMERCIEMENTS ................................................................................................v TABLE DES MATIERES .................................................................................... vi GLOSSAIRE ............................................................................................................. xi LISTE DES ILLUSTRATIONS ....................................................................... xiii LISTE DES SCHEMAS ..................................................................................... xvii LISTE DES TABLEAUX ................................................................................. xviii CHAPITRE 1 : Introduction
1.1 La vectorisation par les nanoparticules.......................................................................1 1.1.1 Utilisation des nanoparticules pour le ciblage de la voie endoth�liale .......1 1.1.2 Les nanoparticules polym�riques solides de PLA/PLGA............................4 1.1.3 Les nanoparticules d’hydrogel .....................................................................8 1.1.4 Param�tres physico-chimiques d�terminant l’interaction particule – cellule ..................................................................................................................10 1.2 M�canique et fonction cellulaire...............................................................................15 1.2.1 Les composants m�caniques de la cellule..................................................15 1.2.2 Approches exp�rimentales pour mesurer les propri�t�s m�caniques d’une cellule ..................................................................................................................20 1.2.3 Mod�lisations des propri�t�s m�caniques des cellules vivantes…………23 1.2.4 Implications du cytosquelette dans l’adh�sion cellulaire et l’endocytose 26

vii 1.3 Hypoth�ses et objectifs .............................................................................................33 1.5 Structure de la th�se ..................................................................................................35 1.3 R�f�rences.................................................................................................................36

CHAPITRE 2 : Techniques exp�rimentales
2.1 La mesure des forces d’interaction entre surfaces ....................................................55 2.1.1 Principe de la mesure .................................................................................55 2.1.2 Effet de la g�om�trie du syst�me et approximation de Derjaguin .............56 2.2 L’appareil de force de surface ..................................................................................57 2.3 La microscopie � force atomique (AFM)..................................................................60 2.3.1 Principe de la mesure .................................................................................60 2.3.2 Le microscope � force atomique ................................................................61 2.3.3 La nano-indentation ...................................................................................62 2.4 Les microscopies � fluorescence...............................................................................65 2.4.1 Origines de la fluorescence........................................................................65 2.4.2 La microscopie � fluorescence...................................................................65 2.5 R�f�rences.................................................................................................................67

CHAPITRE 3 : Selectins Ligand Decorated Drug Carriers for Activated Endothelial Cell Targeting
3.1 Introduction...............................................................................................................70 3.2 Experimental Procedures ..........................................................................................72 3.2.1 Materials.....................................................................................................72 3.2.2 Ligand docking simulations .......................................................................72 3.2.3 Ligand synthesis.........................................................................................73 3.2.4 Polymer synthesis and subsequent ligand conjugation and deprotection ..77 3.2.5 NPs preparation..........................................................................................78 3.2.6 NPs characterization ..................................................................................78

viii 3.2.7 In vitro binding assays ...............................................................................80 3.2.8 Statistical analysis ......................................................................................81 3.3 Results.......................................................................................................................81 3.3.1 Ligand docking Simulations ......................................................................81 3.3.2 Ligand and Polymer Synthesis...................................................................83 3.3.3 Preparation and Characterization of NPs ...................................................84 3.3.4 Binding capacity of the NPs in vitro..........................................................87 3.4 Discussion.................................................................................................................91 3.5 References.................................................................................................................93

CHAPITRE 4 : Direct measurement of Mechanical and Adhesive Properties of Living Cells using the Surface Forces Apparatus
4.1 Introduction...............................................................................................................97 4.2 Experimental Procedures ..........................................................................................99 4.2.1 Materials.....................................................................................................99 4.2.2 Chemical grafting of APTES and glutaraldehyde onto mica surfaces.....100 4.2.3 Chemical grafting of FN and PLL onto glutaraldehyde-functionalized mica surfaces.....................................................................................................101 4.2.4 Cell culture and cell monolayer formation on functionalized mica surfaces..............................................................................................................101 4.2.5 Optical microscopy ..................................................................................101 4.2.6 SFA measurements ..................................................................................102 4.2.7 AFM measurements .................................................................................103 4.3 Results and discussion ............................................................................................103 4.4 Conclusion ..............................................................................................................116 4.5 Internalisation de NPs de PLA par des macrophages d�pos�s sur diff�rents substrats fonctionnalis�s ..............................................................................................................116 4.5.1 Protocole exp�rimental ...........................................................................117 4.5.1.1 Fonctionnalisation du mica ..................................................117

ix 4.5.1.2 Culture cellulaire et internalisation des particules de PLA..117 4.5.2 R�sultats..................................................................................................118 4.6 R�f�rences...............................................................................................................119

CHAPITRE 5 : Effect of Mechanical Properties of Hydrogel Nanoparticles on Macrophage Cell Uptake
5.1 Introduction.............................................................................................................124 5.2 Materials and Methods............................................................................................125 5.2.1 Materials...................................................................................................125 5.2.2 Nanoparticles synthesis............................................................................126 5.2.3 Nanoparticles characterization.................................................................126 5.2.4 Immobilization of the nanoparticles NPs on mica surfaces .....................127 5.2.5 Mechanical characterization of the nanoparticles ....................................128 5.2.6 Cell Culture ..............................................................................................129 5.2.7 NPs Cytotoxicity ......................................................................................130 5.2.8 Uptake study ............................................................................................130 5.2.9 Intracellular trafficking ............................................................................130 5.2.10 Statistical Analysis.................................................................................130 5.3 Results.....................................................................................................................131 5.3.1 Particle Size, zeta potential and morphology...........................................131 5.3.2 Mechanical Properties of the NPs ............................................................133 5.3.3 Cytotoxicity of the NPs............................................................................134 5.3.4 Uptake Mechanism ..................................................................................135 5.3.5 Effect of NP concentration on cellular uptake .........................................138 5.3.6 Uptake Kinetics........................................................................................139 5.3.7 Intracellular trafficking ............................................................................140 5.4 Discussion...............................................................................................................143 5.5 Conclusions.............................................................................................................145

x 5.6 References...............................................................................................................145

CHAPITRE 6 : Discussion G�n�rale
6.1 Le ciblage de la voie endoth�liale...........................................................................148 6.2 Effet de l’�lasticit� cellulaire sur la capacit� d’internalisation des nanoparticules 152 6.3 Effet des propri�t�s �lastiques des nanoparticules sur leur capacit� de p�n�tration cellulaire........................................................................................................................155 6.4 R�f�rences...............................................................................................................159

CHAPITRE 7 : Conclusions et perspectives ................................................161

xi

GLOSSAIRE

Symboles scientifiques :
δ μ ν νs
a Aint D E F(D) kB K Mn Mw ND pH P Patm R R0 T W D�formation relative Indice de r�fraction ratio de Poisson vitesse de s�paration Rayon de l’aire de contact entre deux surfaces Aire de contact effective Distance de s�paration Module de Young Loi de force Constante de Boltzmann Module de flexion Masse molaire en nombre d’un polym�re Masse molaire en poids d’un polym�re Densit� surfacique cellulaire Potentiel hydrog�ne Pression Pression atmosph�rique Rayon de courbure Rayon cellulaire Temp�rature Energie d’interaction entre deux plans infinis

xii

Techniques exp�rimentales :
AFM SFA ToF SIMS Microscopie � force atomique Appareil de mesure de forces de surface Time of Flight Secondary Ionization Mass Spectroscopy

xiii

LISTE DES ILLUSTRATIONS

Figure 1.1 : Micrographies obtenues par microscopie �lectronique � transmission repr�sentant les filaments d’actine, les filaments interm�diaires et les microtubules ....15 Figure 1.2 : Repr�sentation sch�matique d’un filament d’actine ..................................16 Figure 1.3 : Repr�sentation sch�matique d’un microtubule ..........................................18 Figure 1.4 : Diagramme en ruban montrant la structure enroul�e des deux h�lices α constituant l’unit� structurelle des filaments interm�diaires ..........................................19 Figure 1.5 : Repr�sentation sch�matiques des diff�rentes technique utilis�es pour mesurer les propri�t�s m�caniques cellulaires................................................................21 Figure 1.6 : Repr�sentation g�n�rale des mod�les m�caniques des cellules vivantes ...24 Figure 1.7 : Repr�sentation sch�matique des possibles fonctions de l’actine dans les diff�rentes voies d’endocytose........................................................................................31 Figure 2.1 : G�om�trie g�n�rale utilis�e pour la mesure des forces d’interaction entre deux
surfaces ainsi que les param�tres importants qui doivent �tre contr�l�s et/ou mesur�s ............47

Figure 2.2 : Repr�sentation sch�matique de l’appareil de mesure de forces de surface 49 Figure 2.3 : Principe de la mesure de distance en SFA ..................................................50

xiv Figure 2.4 : Repr�sentation sch�matique du microscope � force atomique...................52 Figure 2.5 : Sch�ma de principe des trois types de microscopies : (a) microscopie optique ; (b) microscopie � �pifluorescence et (c) microscopie confocale.....................57 Figure 3.1 : Conformation of the ligand in the bonded state obtained from docking experiments. ....................................................................................................................73 Figure 3.2 : Partial TOF-SIMS spectrum (40-46 amu). (A) NPs made of PLA; (B) NPs made of PLA and PLA-SEL5% (50:50) and (C) NPs made of PLA-SEL5% alone..........75 Figure 3.3 : Cytotoxicity assays of NPs on endothelial cells and rat macrophages.......76 Figure 3.4 : Normalized E and P-selectin expression quantification from fluorescence microscopy in response to LPS and L-NAME activation...............................................77 Figure 3.5 : Fluorescent micrographs of HUVECs activated with LPS (B and C) and with L-NAME (E and F).................................................................................................78 Figure 3.6 : Fluorescence spectrophotometry demonstrates that binding of the NPs is regulated by receptor expression ....................................................................................79 Figure 3.7 : Fluorescent microscopy was used to assess localization of the NPs on LPS activated cell surface.......................................................................................................80 Figure 3.8 : Fluorescence spectrophotometry demonstrated that free ligand can inhibit binding of NPs bearing ligand molecules ...................................................................81

Figure 4.1 : AFM images of PLL and FN coatings on freshly cleaved mica and glutaraldehyde-coated substrates ....................................................................................94

xv Figure 4.2 : Schematic representation of a cell monolayer deposited on a functionalized mica surface. ...................................................................................................................95 Figure 4.3 : (a) Microscopy imaging of a cell monolayer under different compression forces, and (b) the corresponding FECO fringes. (c) FECO fringes corresponding to the mica–mica contact in air, (d) microscopy imaging of the cell monolayer after decompression. Scale bars represent 50μm ....................................................................97 Figure 4.4 : Compression force profiles of a cell monolayer plated on a FN-coated substrate and on a PLL-coated substrate ........................................................................98 Figure 4.5 : Variation of the rupture force between the cells and the substrate...........103 Figure 4.6 : Internalisation de particules de PLA fluorescentes par des macrophages murins d�pos�s sur diff�rents substrats.........................................................................108 Figure 5.1 : Surface imaging of the hydrogel nanoparticles (A) deposited from PBS solution at 37 �C on mica surfaces and analyzed using AFM in air at 25 �C in tapping mode (see methodolgy for details) (B) NPs deposited on glass slides by self-adsorption from PBS solution at 37 �C and analyzed using fluorescence microscopy. .................122 Figure 5.2 : Characteristic force curves measured using AFM between a cantilever tip and one nanoparticle grafted on mica surface for the 4 NP batches.............................123 Figure 5.3 : Cytotoxicity of hydrogel NPs (100 μg/mL) on macrophage RAW 264.7 cell line evaluated using (A) MTT and (B) LDH assays .............................................125 Figure 5.4 : Cellular uptake mechanisms of the NPs assessed by treating the cells with different inhibitors of endocytic entry routes ...............................................................126

xvi Figure 5.5 : Fluorescence micrographs of macrophage cells incubated simultaneously for 1 h with DX-FITC and NPs from batch A to D. .....................................................128 Figure 5.6 : Effect of the NPs concentration of the uptake concentration by macrophage cells...........................................................................................................129 Figure 5.7 : Uptake kinetics of NPs by macrophage cells ...........................................130 Figure 5.8 : (A) Percentage of colocalization of DX-FITC to rhodamine B labeled NPs (B) Fluorescence microscopy of rhodamine B labeled NPs in RAW 264.7 cells at different times after internalization...............................................................................131 Figure 5.9 : Fluorescence micrograph showing colocalization of NPs with early endosome marker EEA-1..............................................................................................132 Figure 6.1 : Repr�sentation sch�matique du changement de m�canisme d’entr�e des NPs d’hydrogel en fonction de leur �lasticit� ...............................................................146 Figure 6.2 : Repr�sentation sch�matique des diff�rents mod�les de d�formation possibles induites lors du contact entre une particule d’hydrogel et une membrane cellulaire........................................................................................................................147

xvii

LISTE DES SCHEMAS

Sch�ma 3.1: Chemical structure of the synthetic ligand of E and P-selectin.................63 Sch�ma 3.2: General synthesis of the selectin ligand Chemical structure of the synthetic ligand of E and P-selectin................................................................................63 Sch�ma 3.3: Grafting reaction of the synthetic ligand on a PLA chain and deprotection ................................................................................................................... 74

xviii

LISTE DES TABLEAUX

Table 1.1: Module de Young de l’actine et des filaments d’actine................................17 Table 1.2: Module de Young des microtubules de diff�rents organismes.....................18 Table 1.3: Module de Young de diff�rents mat�riaux contenant de la k�ratine ............20 Table 3.1: Particle size and Zeta potential measurements of the different NPs used in this study .........................................................................................................................74 Table 4.1: Mechanical parameters of cells obtained by fitting the capsule model (CM), Hertz theory (HT) and the extended Hertz theory (Tatara model, EHT) to the experimental force profiles ...........................................................................................100 Table 5.1: Properties of the hydrogel nanoparticles used in the present study. All measurements were done in PBS at 37 �C....................................................................124

CHAPITRE 1 INTRODUCTION GENERALE

1.1 La vectorisation par les nanoparticules
1.1.1 Utilisation des nanoparticules pour le ciblage de la voie endoth�liale L’utilisation des nanoparticules polym�riques dans la pr�paration de nouvelles formes pharmaceutiques a fait l’objet de nombreuses �tudes depuis plus de 30 ans.1-3 Leur usage s’est �tendu au fil des ann�es en commen�ant par des formes de dosage oral4 � la lib�ration contr�l�e de principes actif5 et plus r�cemment au ciblage passif et actif.6, 7 Les avantages des vecteurs nanoparticulaires sont nombreux. Par exemple les NPs permettent de maintenir la concentration th�rapeutique de m�dicament lib�r� sur des p�riodes de temps tr�s longues et variables selon les applications, il apporte une am�lioration de l’indice th�rapeutique du m�dicament d�livr�, permettent de diminuer potentiellement les quantit�s de m�dicament ainsi que le nombre d’injections n�cessaires ce qui am�liore la qualit� de vie du patient et enfin elles procurent une augmentation de la stabilit� des m�dicaments � faible temps de vie in vivo telles que les prot�ines et les peptides. Les principaux m�canismes par lesquels le m�dicament encapsul� est relargu� par les nanoparticules sont : o Diffusion du principe actif au travers de la matrice polym�rique o D�gradation enzymatique ou chimique de la matrice polym�rique o Transition de phase, c'est-�-dire un gonflement ou un effondrement de la matrice polym�rique d�clench� par un stimuli physique ou chimique8

1

Plusieurs moyens peuvent �tre employ�s pour contr�ler la biodistribution des particules administr�es. La premi�re m�thode consiste � contr�ler la taille des particules � injecter afin qu’elles ne circulent que dans des capillaires de diam�tre sup�rieure ou �gal au diam�tre des particules. Ainsi les particules de diam�tres sup�rieures � quelques microm�tres seront automatiquement filtr�es dans les capillaires pulmonaires ou seront �limin�es lors du premier passage �pathique. Les particules de diam�tre inf�rieur � 200 nm s’accumulent dans les tissus dont la vascularisation est poreuse, comme c’est le cas des sites d’inflammation et des zones tumorales. Ces deux effets sont dits passifs car ils n’impliquent pas de ph�nom�nes de reconnaissance sp�cifique entre la particule et le tissu cible. Pour qu’un ciblage soit actif il est n�cessaire de greffer sur la particule une mol�cule de reconnaissance d’un r�cepteur pr�sent sur les cellules cibl�es. Plus le r�cepteur sera pr�sent sur le site cibl� plus le ciblage du site sera sp�cifique. Parmi les ligands les plus utilis�s nous citerons les anticorps, les peptides et les facteurs de croissance. Le ciblage de l’endoth�lium repr�sente une cible de choix pour le traitement d’un grand nombre de pathologies comme les maladies cardiovasculaires, pulmonaires, g�n�tiques et canc�reuses. Aujourd’hui la plupart des m�dicaments utilis�s pour le traitement de ces maladies ont tr�s peu d’affinit� pour l’endoth�lium. Le ciblage repr�sente donc une strat�gie tr�s int�ressante qui devrait permettre de lib�rer le principe actif au site m�me de la maladie. Pour cela il est n�cessaire de s�lectionner un r�cepteur qui puisse �tre utilis� comme cible pour l’ancrage du cargo. Plusieurs cibles potentielles de l’endoth�lium ont �t� identifi�es telles les ecto peptidases,9, cav�olaires,
11 10

les prot�ines

les mol�cules d’adh�sion cellulaire,
16

12-14

les r�cepteurs des facteurs de

croissance et les prot�ines de transport.15,

Le r�cepteur doit pr�senter certaines

caract�ristiques pour pouvoir �tre consid�r� comme une cible potentiellement int�ressante. En particulier, il doit �tre pr�sent sur les cellules endoth�liales et absent du flux sanguin ou de la surface des cellules autre qu’endoth�liales sans quoi il y aurait comp�tition entre plusieurs sites actifs et donc une diminution de l’efficacit� du ciblage. De plus la densit� des r�cepteurs sur la membrane cellulaire doit �tre �lev�e pour permettre l’adh�sion efficace du cargo. Par exemple, certaines prot�ines de l’adh�sion cellulaire comme PECAM-1 pr�sentent des millions de copies par cellule12 et l’enzyme

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de conversion de l’angiotensine (ACE) est exprim�e constitutivement � plusieurs centaines de milliers de copies par cellule.17 De plus des facteurs pathologiques peuvent affecter l’expression de certains r�cepteurs membranaires. Par exemple la mol�cule d’adh�sion intercellulaire ICAM-1 et d’autres mol�cules comme les s�lectines sont fortement exprim�es dans les sites d’inflammation, de thrombose et d’isch�mie.18-20 Dans ces conditions il est n�cessaire que l’adh�sion du cargo sur le site cible puisse se faire durant l’intervalle de temps d’expression de ces r�cepteurs. Le ciblage de la voie endoth�liale est une strat�gie tr�s prometteuse pour le traitement de maladie ayant une composante inflammatoire importante comme le cancer ou l’arthrose rhumato�de. Les capillaires enflamm�s sont connus pour exprimer un certain nombre de r�cepteurs tels que les s�lectines E et P et ICAM-1. Ces m�mes r�cepteurs peuvent �tre utilis�s pour l’adressage de nanoparticules fonctionnalis�es afin de lib�rer le principe actif de mani�re prolong�e au site enflamm�. Zang et al.21 ont utilis� des nanoparticules de PLGA fonctionnalis�es en surface avec un ligand peptidique ciblant le r�cepteur ICAM-1 connu pour �tre surexprim� sur les cellules endoth�liales activ�es. Leur �tude a montr� que la quantit� de nanoparticules fonctionnalis�es internalis�es par les cellules endoth�liales de cordon ombilical humain (HUVEC) �tait deux fois plus importante que celle de leurs homologues non fonctionnalis�s. Ces r�sultats montrent que le ciblage des cellules endoth�liales activ�es est possible et ouvrent de nouveaux axes de recherches pour tester d’autres r�cepteurs eux aussi exprim�s par les tissus enflamm�s, notamment les s�lectines E et P. Il est � noter que la fonctionnalisation en surface des nanoparticules pose le probl�me de la stabilit� du ligand � la surface des nanoparticules. En effet, la fonctionnalisation des nanoparticules n�cessite des �tapes de synth�se et de purification suppl�mentaires. Le lien chimique permettant de coupler le ligand � la particule est g�n�ralement peu stable dans un milieu de culture cellulaire o� la pr�sence d’enzymes et le pH acc�l�rent son hydrolyse. La disparition du ligand de la surface de la nanoparticule diminue fortement l’efficacit� du ciblage et l’internalisation du vecteur. Il est donc n�cessaire de d�velopper de nouvelles techniques de formulation de nanoparticules permettant de maintenir des concentrations de ligand en surface suffisantes pour conserver la fonction de ciblage du vecteur.

3

1.1.2 Les nanoparticules polym�riques solides de PLA/PLGA De nombreux types de nanoparticules polym�riques ont �t� con�ues en utilisant un ou plusieurs des m�canismes de lib�ration mentionn�s. Dans ce qui suit, nous mentionnerons les plus repr�sentatifs � titre d’illustration. La premi�re utilisation de nanoparticules polym�riques pour des fins th�rapeutiques date des ann�es 1970 par Speiser et al.22,
23

Depuis, les nanoparticules ont �t�

amplement �tudi�es comme syst�me cargo de principes pharmaceutiques mol�culaires ou macromol�culaires comme les acides nucl�iques, les peptides, les prot�ines et les hormones.24-27 Un des grands avantages des nanoparticules sur les autres types de vecteurs est leur taille sub microm�trique qui leur permet de diffuser hors du flux sanguin par extravasation et de limiter l’occlusion des vaisseaux sanguins. 28 L’agent th�rapeutique peut �tre dispers� dans la matrice polym�rique formant la nanoparticule ou bien �tre encapsul� dans le cœur hydrophobe d’une nanocapsule.29, 30 La lib�ration du principe actif pr�sente deux phases, la premi�re �tant reli�e � la diffusion du principe actif � travers la matrice polym�rique et la deuxi�me incluant le processus de diffusion et celui de d�gradation de la nanoparticule.31 Les copolym�res d’acide lactique et d’acide glycolique (PLGA) poss�dent un certain nombre d’avantages sur les autres polym�res couramment utilis�s dans le domaine des syst�mes � relargage contr�l�. On mentionnera, entre autres, leur biod�gradabilit�, leur biocompatibilit� et leur approbation pour usage chez l’humain par la Federal Drug Agency.32 Le PLGA se d�grade chimiquement dans le corps humain par clivage hydrolytique du lien ester joignant les acides lactique et glycolique.33 Ces r�sidus sont facilement m�tabolis�s par le corps humain via le cycle de Krebs et sont �limin�s sous forme de CO2 et d’eau.34 Le processus de d�gradation des polym�res in vivo et in vitro est affect� par diff�rents facteurs incluant la technique de pr�paration, la pr�sence de macromol�cules de faible masse mol�culaire, la taille, la forme et la morphologie, les propri�t�s intrins�ques du polym�re32 (si il est hydrophile ou hydrophobe, son poids mol�culaire, sa structure chimique, sa cristallinit�, sa temp�rature de transition vitreuse), les param�tres physicochimiques ambiants (le pH, la temp�rature et la force

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ionique), le site d’implantation et le m�canisme d’hydrolyse. La d�gradation physique du PLGA se fait principalement par �rosion. Le processus de d�gradation se fait principalement en trois phases.32 Initialement, une d�croissance du poids mol�culaire du polym�re est observ�e sans perte appr�ciable de polym�re et sans aucune formation de monom�res form�s par la scission des cha�nes. Cette phase est suivie par une d�croissance rapide du poids mol�culaire et d’une perte de masse accompagn�e de la formation de monom�res et oligom�res. Finalement, la d�gradation des oligom�res en monom�res entra�ne la d�gradation compl�te du polym�re.32Les produits de d�gradation du PLGA se forment � des vitesse tr�s lentes ce qui n’affecte pas la fonction cellulaire. Les polym�res de PLGA ont �t� test�s pour leur toxicit� dans de nombreuses �tudes sur l’animal et sont d�j� utilis�s chez l’humain comme sutures d�gradables ou comme implants osseux et contraceptifs.35,
36

La biocompatibilit� du

PLGA � long terme a �t� d�montr�e par l’absence de complication apr�s injection intra art�rielle de nanoparticules de PLGA chez le rat et le porc.24, 37 Les nanoparticules de PLGA sont rapidement �limin�es de la circulation syst�mique par le syst�me r�ticulo endoth�lial (RES) apr�s injection intraveineuse. Deux familles d’opsonines (les facteurs du compl�ment et les immunoglobulines) s’absorbent principalement sur les nanoparticules et facilitent leur phagocytose d�clenchant ainsi l’inflammation et une r�ponse des tissus. Ceci r�duit fortement l’efficacit� des nanoparticules pour livrer leur charge au site cibl�. Ce probl�me a soulev� un fort int�r�t pour le d�veloppement de nanoparticules furtives capables de circuler dans le flux sanguin durant de longues p�riodes de temps et pouvant cibler des tissus autre que le syst�me phagocytaire mononucl��. Les principaux proc�d�s de pr�paration de syst�mes nanoparticulaires � livraison de m�dicament sont les suivants : la technique d’�mulsification/�vaporation, la technique de double �mulsion, la technique par pr�cipitation saline et la technique de nano pr�cipitation. La technique d’�mulsification/�vaporation est certainement la plus utilis�e. Le polym�re pr�form� et l’agent th�rapeutique sont dissous dans un solvant organique hydrophobe et sont ensuite �mulsifi�s dans une solution contenant un agent stabilisant. L’�mulsification est ensuite poursuivie dans un appareil apportant un effort cisaillant tr�s important de sorte � r�duire la taille des particules (moulins collo�daux,

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homog�n�isateur � haute pression, bain � ultrasons). La phase organique est ensuite �vapor�e sous pression r�duite et la suspension collo�dale est r�cup�r�e apr�s plusieurs ultracentrifugations.38, 39 Pour palier au probl�me de faible r�tention des principes actifs hydrophiles observ� dans la technique d’�mulsification/�vaporation, la technique de double �mulsion est souvent utilis�e. Dans une premi�re �tape le principe actif hydrophile est dissous dans une solution aqueuse et est �mulsifi� dans une solution organique contenant le polym�re pr�form�. Cette �mulsion eau dans huile est ensuite ajout�e � une solution aqueuse contenant l’agent stabilisant et est �mulsifi�e � son tour. La double �mulsion est ensuite soumise aux m�mes traitements que le proc�d� d’�mulsification/�vaporation.33, 40 La technique d’�mulsification/diffusion est aussi une m�thode tr�s souvent utilis�e. Le polym�re est dissous dans un solvant organique partiellement miscible avec l’eau (comme l’ac�tate d’�thyle ou l’alcool benzylique) et pr�alablement satur� d’eau. La solution est ajout�e sous agitation vigoureuse � une solution aqueuse contenant l’agent stabilisant. L’addition d’eau provoque une d�stabilisation de l’�quilibre entre la phase aqueuse et la phase organique entra�nant la diffusion du solvant dans la phase aqueuse. Ce processus de diffusion s’accompagne de la formation de nanoparticules qui s’appauvrissent graduellement en solvant.38,
41

La

technique par pr�cipitation saline (salting-out) consiste � dissoudre le polym�re dans un solvant partiellement miscible avec l’eau (comme l’ac�tone) et de m�langer le tout � une solution aqueuse satur�e en sel et contenant l’agent stabilisant. Apr�s agitation vigoureuse, l’�mulsion est dilu�e avec un volume suffisant d’eau entra�nant la formation des nanoparticules par diffusion du solvant dans la phase aqueuse.42 La technique de nano-pr�cipitation consiste � dissoudre le polym�re et un surfactant lipophile dans un solvant semi-polaire et miscible � l’eau comme l’ac�tone ou l’�thanol. La solution est ensuite inject�e sous agitation vigoureuse dans une solution aqueuse contenant l’agent stabilisant. Les nanoparticules sont form�es instantan�ment par diffusion rapide du solvant vers la phase aqueuse.43, 44 La plupart des m�thodes de pr�paration requi�rent l’utilisation de solvants organiques qui ont tendance � d�naturer les prot�ines � usage pharmaceutique. De plus, pour obtenir des particules de taille nanom�trique, il est n�cessaire d’utiliser de grandes quantit�s de surfactant et des proc�d�s d’�mulsification � hauts efforts cisaillants qui

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peuvent aussi affecter l’int�grit� des macromol�cules utilis�es. La nature toxique de certains solvant n�cessite l’ajout des �tapes de purifications. Le fait que les nanoparticules soient rapidement capt�es par le RES repr�sente un avantage pour certains traitements comme les th�rapies contre le SIDA.45 Cependant, la capture rapide des nanoparticules par les macrophages du foie et de la rate limite leur accessibilit� � d’autres parties du corps humain. Apr�s une injection intra-veineuse, les particules de taille sup�rieure � 1-3 μm de diam�tre sont �limin�es par filtration capillaire dans les poumons alors que les particules de diam�tre inf�rieur � 5 μm sont g�n�ralement �limin�es de la circulation par le RES. Il a �t� d�montr� dans diff�rentes �tudes qu’en recouvrant la surface des nanoparticules � l’aide de macromol�cules ou de ligand il �tait possible de modifier la bio distribution in vivo des nanoparticules. Par exemple, en recouvrant les nanoparticules d’une couche de poly�thyl�ne glycol (PEG), l’absorption de prot�ines s�riques reconnue par le RES est fortement diminu�e. Les nanoparticules peuvent ainsi circuler plus longtemps dans le flux sanguin sans �tre capt�es par le RES.46 Ces nanoparticules furtives poss�dent le potentiel de cibler les sites d’inflammation et les tumeurs ayant des capillaires poreux.47-49 De mani�re g�n�rale, apr�s injection, les nanoparticules de PLGA, furtives ou pas, sont absorb�es via le tissus lympho�de intestinal dans la circulation lymphatique ce qui �vite leur �limination au cours du premier passage h�patique. Le ciblage de la voie lymphatique est avantageux dans le cas des traitements chimioth�rapeutiques car il am�liore la biodisponibilit� perorale des principes pharmaceutiques macromol�culaires comme les polypeptides ou les prot�ines. 50, 51 L’encapsulation de peptides comme l’insuline ou la calcitonine dans des nanoparticules de PLGA couvertes de chitosan ou de Carbopol�, deux polym�res reconnus pour �tre mucoadh�sifs, a permis d’augmenter le temps de lib�ration du m�dicament par voie orale et pulmonaire et de favoriser une forte p�n�tration des NPs dans la paroi mucosale.41 Panyam et al.34 ont aussi montr� que les nanoparticules de PLGA pouvaient �tre capt�es par les cellules des muscles lisses vasculaires et �chapper � la d�gradation lysosomale en s’�vadant dans le cytosol. Ceci permet aux nanoparticules d’agir comme des r�servoirs pour lib�rer lentement l’agent th�rapeutique encapsul�. Le m�canisme responsable de l’�vasion des nanoparticules des compartiments lysosomaux est

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principalement d� � une inversion de charge de la surface des nanoparticules de PLGA dans les lysosomes. 1.1.3 Les nanoparticules d’hydrogel Les nanoparticules d’hydrogel repr�sentent une famille de vecteurs beaucoup plus vaste que les nanoparticules polym�riques solides. Les particules d’hydrogel sont constitu�es d’une matrice polym�rique poreuse �lastique. Le polym�re est g�n�ralement tr�s hydrosoluble ce qui facilite l’entr�e et la sortie de mol�cules d’eau ou de tout autre compos� hydrosoluble. La fabrication de nanoparticules � partir de monom�res acryliques utilise la polym�risation en �mulsion ou en micro-�mulsion.52 Ces techniques sont d’autant plus recommand�es si l’on utilise des monom�res dit thermosensibles comme le N-isopropylacrylamide. Dans ce type de synth�se, le m�canisme de formation des particules s’initie par la polym�risation radicalaire en cha�ne dans la phase aqueuse d’oligom�res qui vont cro�tre et s’effondrer � partir d’une certaine masse mol�culaire. Ces oligom�res formeront des pr�curseurs de particules et capteront les monom�res en solution pour permettre la croissance de la particule. Afin de favoriser la nucl�ation des particules, il est possible d’ajouter un tensioactif qui favorisera la formation d’agr�gats mixtes polym�re-surfactant et la nucl�ation de particules.53 La coh�sion entre les cha�nes polym�riques constituant la particule est achev�e � l’aide d’un monom�re multifonctionnel dit r�ticulant. Parmi les monom�res qui ont �t� �tudi�s on retrouve la N-isopropylacrylamide, le 2-hydroxy ethyl m�thacrylate, l’acide acrylique, la N,N di�thylacrylamide, la N,N dim�thylamine �thyl acrylate.54 Les monom�res amin�s ont �t� utilis�s surtout pour conf�rer aux particules des propri�t�s thermosensibles alors que l’incorporation de monom�res comme l’acide acrylique procure aux particules une sensibilit� au pH. D’autres monom�res ont �t� r�cemment utilis�s pour apporter de nouvelles fonctionnalit�s aux particules. Par exemple l’incorporation de r�ticulant biod�gradable pour la lib�ration de principe actif stimul�e par la pr�sence d’une enzyme ou encore l’ajout de fonctions chimiques permettant le couplage de la particule avec des ligands synth�tiques ou des anticorps.55

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Dans une �tude r�cente, Vihola et col.56 ont montr� que la cytotoxicit� in vitro de plusieurs polym�res thermosensibles, dont le PNIPAM, d�pend de la temp�rature et du temps d'incubation. En effet, lorsque le temps d'incubation est de 3 heures, la cytotoxicit� du PNIPAM est faible � une temp�rature inferieure � la LCST du polym�re et elle augmente faiblement lorsque la temp�rature est sup�rieure � la LCST. Ce ph�nom�ne est observ� pour les polym�res fortement hydrophobes � l'�tat d�shydrat�, comme le PNIPAM ou la poly(N-vinylcaprolactame) (PVCL) mais pas pour des polym�res plus hydrophiles comme la PVCL greff�e avec des chaines pendantes de PEG. Ce ph�nom�ne est encore plus marqu� lorsque le temps d'incubation est augment� de 3 heures � 12 heures. Les auteurs expliquent ces r�sultats en invoquant le fait que le greffage de chaine de PEG sur le polym�re permet de diminuer l'interaction entre le polym�re et la paroi cellulaire par interaction st�rique. D’autres techniques de fabrication utilisant des polym�res naturels comme le chitosan et le dextran, ou des polym�res synth�tiques comme le PVA ont aussi �t� d�velopp�es.55 Leur proc�d� de fabrication se base sur la dispersion du polym�re dans une �mulsion eau dans huile en pr�sence de tensioactifs suivi de la r�ticulation chimique des particules. Si l’utilisation d’hydrogel pour des applications pharmaceutiques a �t� tr�s largement �tudi�e (voir r�f�rences54,
57

pour des revues r�centes) on compte peu d’�tudes

mentionnant l’utilisation de nanoparticules d’hydrogel. Ces �tudes rapportent l’encapsulation de plusieurs principes actifs dans des particules d’hydrogel. Parmi les agents chimioth�rapeutiques, on mentionnera la doxorubicine qui a �t� encapsul�e dans des nanoparticules de pullulan58, de PVA59 et de poly�thyl�ne glycol copolym�ris�es avec le Pluronic F127.60 De plus, You et al.61 ont r�cemment report� l’utilisation de particules de poly (N,N-dim�thylamino�thyl m�thacrylate-co-2-hydroxyethyl m�thacrylate ) pour la lib�ration contr�l�e de l’agent anti-canc�reux paclitaxel. Des principes actifs plus sensibles � la d�gradation enzymatique comme les peptides ont aussi �t� encapsul�s dans des nanoparticules d’hydrogel. En particulier, l’insuline a �t� encapsul�e avec succ�s dans des particules d’acide polym�thacrylique-chitosanpoly�thyl�ne glycol62 et de poly(�thyl�ne glycol) dim�thacrylate-co-acide m�thacrylique.63 Les particules fabriqu�es � base de chitosan et de dextran modifi� sont

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aussi une voie tr�s prometteuse pour l’encapsulation de principes actifs hydrophiles ou hydrophobes.64-66 L’utilisation de nanoparticules d’hydrogel pour le d�veloppement de nouvelles th�rapies a aussi �t� report�e. Par exemple l’encapsulation de mol�cules photosensibles dans des nanoparticules de N-ispropylacrylamide (NIPAM) a �t� utilis�e pour le d�veloppement de th�rapies photo-dynamiques contre le cancer.67-69 L’usage de ces vecteurs nanoparticulaires devrait conna�tre un fort essor dans le domaine clinique d� � leur tr�s faible toxicit� cellulaire70, 71 et � leur tr�s large biodistribution.72 Les �tudes publi�es reportant l’utilisation de nanoparticules d’hydrogel montrent que ce type de vecteur pr�sente de nombreuses qualit�s qui leur sont propres. Notamment la sensibilit� � un stimuli physico-chimique leur permet de lib�rer leur charge de mani�re parfaitement contr�l�e. Malgr� tous ces avantages, tr�s peu d’�tudes fondamentales ont �t� effectu�es pour identifier les facteurs physico chimiques responsables du captage et de l’internalisation de ces vecteurs. Ces vecteurs poss�dant entre autre la particularit� d’�tre m�caniquement �lastique, il est important de conna�tre l’effet de cette propri�t� intrins�que sur l’interaction avec les cellules vivantes. 1.1.4 Param�tres physico-chimiques d�terminant l’interaction particule - cellule Les effets de certains param�tres physico-chimiques sur l’interaction particule / cellule et sur leur devenir intracellulaire ont �t� �tudi�s pour un grand nombre de syst�mes. Les r�sultats les plus significatifs sont les suivants. Effet de la taille des particules L’effet de la taille des particules sur leur devenir intracellulaire est un th�me de recherche des plus important du fait de ses implications dans la lib�ration contr�l�e de m�dicaments et dans la toxicit� associ�e aux nanoparticules.73 Plusieurs propri�t�s importantes des particules in vivo sont associ�es � la taille de particule : le temps de circulation, l’extravasation, le ciblage, l’internalisation, le trafique intracellulaire, la clairance et le m�canisme d’internalisation.74-77 Le diam�tre de particule d�termine leur transport et leur adh�sion dans les capilaires sanguins, les voies a�riennes et gastro-

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intestinales.78-80 Il existe de nombreux m�canisme de clairance dans le sang.81 Les microparticules sont captur�es par les cellules de Kupffer dans le foie ou bien elles sont physiquement attrap�es dans le lit des capillaires.81, 82 Les nanoparticules en revanche, peuvent quitter les vaisseaux sanguins gr�ce � la fenestration des capillaires.82, 83 Les particules de diam�tre sup�rieure � 500 nm sont captur�es et phagocyt�es par les macrophages alors que les particules plus petites peuvent �tre endocyt�es par des cellules phagocytaires ou non-phagocytaires.84, 85 L’internalisation de nanoparticules de polystyr�ne par des cellules canc�reuses a �t� report�e pour des tailles de particules variant de 50 nm a 1000 nm.84 Les particules ayant une taille inf�rieure � 500 nm sont internalis�es par un m�canisme �nergied�pendant. Les particules de taille inf�rieure � 200 nm sont internalis�es par la voie des clathrines alors que les particules de taille sup�rieure � 200 nm sont pr�f�rentiellement internalis�es via la voie cav�olaire. La destruction du r�seau de microtubule affecte fortement le trafic intracellulaire des particules ayant un diam�tre inf�rieur � 500 nm. Les particules de taille inf�rieure � 500 nm convergent vers les lysosomes alors que les particules de taille sup�rieure � 500 nm s’accumulent dans des compartiments neutres. Suivant la m�me lign�e de recherche, Limbach et al. ont �tudi� l’effet de la taille de particule sur l’internalisation de particules d’oxyde de c�rium par des fibroblastes du poumon.86 Leur r�sultats ont montr� que la taille des particules �tait le param�tre d�terminant majoritairement la quantit� internalis�e devant la concentration et l’aire sp�cifique des particules. Les auteurs ont montr� que les particules de tailles inf�rieures � 50 nm s’agglom�raient tr�s vite alors que les particules de 200 nm �taient plus stable dans le milieu de culture. Cette instabilit� des particules de petite taille serait � l’origine, selon les auteurs, de l’internalisation �lev�e des particules de taille inf�rieure � 50 nm comparativement � celles de taille de l’ordre de 200 nm. Lohbach et al. ont r�alis� une �tude similaire en utilisant des particules fluorescentes dont la taille variait de 50 nm � 1000 nm.87 Les auteurs ont trouv� que la quantit� de particules internalis�es �tait maximale pour les particules de 50 nm de diam�tre et qu’elle pouvait encore �tre augment�e en adsorbant sur les particules du chitosan ou en greffant un motif de lectine.

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R�cemment Lai et al.88,

89

ont d�montr� que des particules de polystyr�ne de taille

inf�rieure � 40 nm �taient capables de p�n�trer dans des cellules endoth�liales HUVEC et �pit�liales HeLa via un m�canisme n’impliquant pas la voie des clathrines. Cette �tude a montr� que les particules de taille inf�rieure � 25 nm poss�dent la capacit� d’�chapper au trajet endosome-lysosome et s’accumulent autour du noyau cellulaire. Cette nouvelle trajectoire intracellulaire est cholest�rol-ind�pendante, clathrinesind�pendante et caveolae-ind�pendante. Ces r�sultats sont tr�s prometteurs pour l’administration de principes actifs sensibles � la d�gradation comme les prot�ines ou l’ADN car il permettrait � un vecteur de livrer sa charge pr�s du noyau cellulaire sans passer par les lysosomes.90 Effet de la forme des particules L’effet de la forme des NPs sur leur interaction et internalisation par des cellules macrophagiques a �t� rapport� pour des NPs de polystyr�ne microm�triques.91 La vitesse de phagocytose de particules non sph�riques mais � sym�trie cylindrique est d�termin�e par l’angle tangentiel au point de contact entre la paroi cellulaire et l’axe principal de r�volution la particule. Pour des angles inf�rieurs � 60 degr�s, les particules sont internalis�es ind�pendamment de leur forme alors que pour des angles sup�rieurs � 60 degr�s la cellule s’�tale sur la particule sans l’internaliser. Ce r�sultat montre que c’est la g�om�trie locale de la particule qui en structurant le r�seau d’actine cellulaire d�termine si la cellule s’�tale sur la particule ou si elle l’internalise. Ces r�sultats ayant �t� obtenus avec des microparticules, il est difficile de les extrapoler � des tailles plus petites. En effet, les d�formations m�caniques d�velopp�es par la cellule au moment de la phagocytose d’un objet microm�trique peuvent �tre du m�me ordre de grandeur que la taille de la cellule ce qui n’est �videmment pas le cas si l’objet phagocyt� a une taille de l’ordre de quelques centaines de nanom�tres ou moins. Muro et al.92 ont �tudi� l’effet de la forme du vecteur (sph�rique ou disco�dale) sur son internalisation par les cellules endoth�liales in vivo et in vitro. Dans cette �tude, l’endoth�lium �tait cibl� en fonctionnalisant les particules avec un anticorps antiICAM. In vivo, les vecteurs sph�riques de taille microm�trique sont rapidement �limin�s du flux sanguins (en moins de 30 min) alors que les particules sub-

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microm�triques circulent plus longtemps. Les vecteurs disco�daux r�sident plus longtemps dans le flux sanguin que leurs homologues sph�riques et s’accumulent fortement dans les poumons. In vitro, les vecteurs sph�riques microm�triques sont internalis�s plus rapidement que les disco�daux. Le m�canisme d’internalisation des vecteurs est le m�me, ind�pendamment de la forme des particules et semble suivre le trajet endosome-lysosome sans toutefois prendre les voies d’entr�es d�j� connues (classique, cav�olaire ou macropinocytique). Cette voie de trafic intracellulaire est sp�cifique au r�cepteur cibl� (ICAM) et est ind�pendante de la forme ou de la taille du vecteur. Les r�sultats de cette �tude montrent aussi un r�le pr�pond�rant des filaments d’actine dans l’internalisation et le trafic de ces vecteurs. En effet, apr�s internalisation, le r�seau de filaments d’actine est fortement modifi� et pr�sente de nombreuses fibres sur lesquelles s’alignent les particules. Ceci constitue la premi�re �vidence d’un remodelage complet du cytosquelette induit par l’entr�e des particules. Decuzzi et al.93 ont montr� que l’effet de la g�om�trie du vecteur sur sa capacit� d’internalisation pouvait �tre expliqu� par un mod�le m�canique simple prenant en compte l’�nergie d’interaction cellule - particule (d�termin�e par le nombre de sites d’adh�sion ligand-r�cepteur) et l’�nergie de d�formation de la membrane cellulaire (dont la contribution la plus importante est l’�nergie de flexion). Pour des particules cylindriques, les auteurs ont d�montr� que le param�tre d’asym�trie des particules (le ratio longueur sur largeur) permet de pr�dire si il y a internalisation ou pas. Effet de la charge de surface La charge superficielle des particules est un facteur affectant aussi bien l’interaction avec les cellules que le devenir intracellulaire des NPs. La surface des cellules est charg�e n�gativement d� entre autre � la pr�sence des prot�ines prot�oglycanes h�paran sulfate n�gativement charg�es sur la membrane cellulaire externe. Les particules positivement charg�es auront donc une plus forte affinit� pour la membrane cellulaire que leurs homologues neutres ou n�gativement charg�es. Ce ph�nom�ne a �t� observ� in vitro pour de nombreux syst�mes qui d�montrent une capacit� d’internalisation des particules cationiques syst�matiquement plus �lev�e.94, 95

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Le m�canisme d’internalisation des nanoparticules est aussi affect� par la charge des nanoparticules. Par exemple, les dendrim�res positivement charg�s et neutres sont internalis�s par les cellules �pith�liales du poumon par une voie autre que cav�olaire ou clathrine d�pendante alors que les dendrim�res anioniques p�n�trent dans les cellules par la voie cav�olaire.96 Les particules de PLA-PEG charg�es positivement ou n�gativement entrent par la voie des clathrines dans les cellules �pith�liales du rein.97 Leur trajectoire intracellulaire pr�sente malgr� tout quelques diff�rences : les particules anioniques convergent en partie vers les organelles digestives alors que les particules cationiques privil�gient le trajet par la paroi cellulaire lat�rale (situ�e sous les jonctions serr�es). L’effet de la charge des nanoparticules sur leur capacit� de p�n�tration de la paroi mucosale a �t� �tudi� mais demeure toujours un sujet de controverse. Les particules positivement charg�es et neutres pr�sentent g�n�ralement une forte affinit� pour l’�pith�lium associ� aux follicules ainsi qu’aux ent�rocytes alors que les particules n�gativement charg�es pr�sentent tr�s peu d’affinit� pour les tissus gastrointestinaux.25 Effet des propri�t�s m�caniques du substrat Les cellules adh�rentes poss�dent la capacit� de � tester � l’�lasticit� d’un substrat en s’y attachant fermement et en le d�formant.98 Cette capacit� d�pend en partie de la contractilit� du cytosquelette impliquant le moteur mol�culaire myosine et des prot�ines de l’adh�sion transcellulaire telles les int�grines et les cadh�rines. Les cellules non seulement appliquent des forces sur le substrat mais r�pondent � la r�sistance � sa d�formation en modifiant la structure de leur cytosquelette. Des corr�lations entre l’adh�sion cellulaire et l’accroissement de la contractilit� cellulaire ont �t� mises en �vidence99 et il semble maintenant que cette capacit� sensorielle de d�tecter la raideur d’un substrat soit d�pendante de l’adh�sion , du cytosquelette et de la contractilit� cellulaire.100 On sait aujourd’hui que la contractilit� cellulaire, et par cons�quent l’adh�sion, sont impliqu�es dans un grand nombre de processus cellulaires. L’endocytose est un de ces processus qui implique entre autre la structure du r�seau de filaments d’actine. Kong et al.101 ont �tudi� l’internalisation de nanoparticules polym�riques par des ost�oblastes de souris d�pos�s sur un substrat polym�rique r�ticul�. L’�tude a montr� que l’internalisation du vecteur augmentait avec le module

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de Young du substrat. Dans une autre �tude,102 il a �t� montr� que l’internalisation du vecteur �tait aussi d�pendante de la densit� de ligands greff�s sur le substrat. Ces deux �tudes d�montrent qu’il existe une relation �troite entre la contractilit�, l’adh�sion cellulaire et l’endocytose. Ces r�sultats r�cents ouvrent la porte � de nombreuses interrogations. Par exemple, si la cellule est capable de sentir la rigidit� d’un substrat, elle doit �tre capable d’en faire de m�me avec le vecteur nanoparticulaire au moment de leur contact. La rigidit� du vecteur peut-elle � son tour moduler son internalisation ? De plus, si la densit� de ligands greff�s sur le substrat peut moduler le captage des nanoparticules, il se peut �galement que leur orientation ou leur type d’attachement � la surface affecte l’internalisation.

1.2 M�canique et fonction cellulaire
1.2.1 Les composantes m�caniques de la cellule Les cellules eucaryotes poss�dent trois classes principales de filaments constituant leur cytosquelette. La Figure 1.1 illustre des micrographies obtenues par microscopie �lectronique de chacune des trois familles de filament Les filaments d’actine, aussi appel�s microfilaments, ont une structure de c�ble d’un diam�tre d’environ 6 nm. Les filaments interm�diaires ont une structure s’apparentant � celle d’une fibre tress�e compos�e de plusieurs fils enchev�tr�s ; leur diam�tre est d’environ 10 nm. Les microtubules ont une structure tubulaire de diam�tre externe d’environ 25 nm et de diam�tre interne environ 18 nm.

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A

B

C

Figure 1.1 : Micrographies obtenues par microscopie �lectronique � transmission dans lesquelles nous pouvons voir : (A) Les filaments d’actine, d’un diam�tre d’environ 6 nm ; (B) Les filaments interm�diaires de 10 nm de diam�tre et ayant une courbure plus prononc�e que les filaments d’actine indiquant qu’ils sont aussi plus flexibles ; (C) Les microtubules, de 25 nm de diam�tre. Les stries pr�sentes sur les microtubules correspondent aux protofilaments.103 Un filament d’actine est un assemblage en double h�lice de prot�ines d’actine dont la longueur de persistance est de l’ordre de 15 μm (voir la Figure 1.1A et Figure 1.2).104 La p�riode de rotation du filament est de 72 nm et contient 26 sous unit�s d’actine. L’actine repr�sente � peu pr�s 1-10 % de la masse prot�ique totale d’une cellule non musculaire et jusqu'� 20 % d’une cellule musculaire. L’actine �tant une prot�ine dissym�trique, le filament d’actine est polaire et ses extr�mit�s sont structurellement diff�rentes. Une cons�quence directe de cette polarit� est une diff�rence marqu�e de la vitesse de polym�risation de l’actine entre les deux extr�mit�s du filament. L’extr�mit� poss�dant la vitesse de polym�risation la plus �lev�e est alors appel�e plus (+) alors que l’extr�mit� ayant une croissance moins rapide est appel�e moins (-). La polym�risation de l’actine joue un r�le pr�pond�rant dans la formation des filopodes et lamellipodes qui

16

apparaissent lors de la premi�re �tape de la migration cellulaire. Les filaments d’actine peuvent s’organiser en une structure tertiaire comme des r�seaux ou en bouquets � l’aide de prot�ines qui leur sont associ�es. Dans la cellule, les r�seaux de fibre d’actine s’attachent et se concentrent autour des sites d’adh�sion entre la membrane cellulaire et le substrat.

Figure 1.2 Repr�sentation sch�matique d’un filament d’actine montrant la structure en h�lice. Chaque sph�re repr�sente une unit� structurelle (d’apr�s la r�f�rence 103 ). Le Tableau 1.1 donne les valeurs du module de Young de l’actine et des filaments d’actine obtenues par diff�rents modes de d�formation.

Tableau 1.1 Module de Young (GPa) de l’actine et des filaments d’actine Mode de d�formation Traction Flexion Torsion Filament d’actine 2.3105 Actine seule 2.3106 1.3107, 2.6108 1.5109

L’unit� primaire formant les microtubules est un h�t�rodim�re αβ de tubuline tr�s stable qui ne peut �tre dissoci� que par des traitements chimiques tr�s forts (comme l’ajout de d�tergent). Les dim�res s’associent dans la direction queue-t�te pour former un protofilament. Les protofilaments s’associent lat�ralement pour former un feuillet qui se referme pour former un tube cylindrique, le microtubule (voir Figure 1.3).110 Le microtubule, tout comme le filament d’actine, est polaire. Les microtubules sont

17

g�n�ralement form�s de 13 protofilaments mais leur polymorphisme est assez �lev�, ainsi des microtubules de 8 � 19 protofilaments ont d�j� �t� report�s. Les microtubules sont les principaux responsables de la forme des cellules et jouent un r�le pr�pond�rant dans la migration cellulaire, sp�cialement durant la mitose. Certaines mol�cules comme la vincristine ou la vinblastine s’associent � la tubuline et peuvent �liminer l’addition de monom�res au microtubule supprimant ainsi la mitose.

A

B

Figure 1.3 (A) Repr�sentation sch�matique d’un microtubule compos� de 13 protofilaments. (B) Structure � basse r�solution d’un microtubule d�duite par cryomicroscopie �lectronique.103 Du fait de leur couplage m�canique avec le cytosquelette, les microtubules peuvent supporter de grands efforts en compression.111 Le tableau 1.2 rapporte quelques unes des propri�t�s m�caniques des microtubules de diff�rents organismes.

18

Tableau 1.2 Module de Young (GPa) des microtubules de diff�rents organismes Mode de d�formation Flexion Flexion Flexion
a

Organisme Cerveau bovin Sperme d’oursin de mera CO2 ADP + V

Module d’Young 1.9 2.7 2.1

L’�lasticit� d�pend de l’�tat physiologique du sperme. L’ajout d’ADP ou de vanadate ou

la pr�sence de CO2 permet de relaxer le microtubule. La variation de l’�lasticit� est due � la pr�sence de r�ticulation par la dyn�ine entre les doublets de microtubules.

L’unit� structurale des filaments interm�diaires est un dim�re de deux h�lices α parall�les. Ces h�lices sont hydrophobes d’un c�t� et hydrophiles de l’autre ce qui leur permet de s’associer en pr�sence de solvant (voir Figure 1.4). L’organisation structurelle de ces dim�res dans le filament n’est pas encore connue et il est possible que leur arrangement diff�re d’une classe � l’autre. Un mod�le d’organisation consid�re deux dim�res associ�s antiparall�lement pour former un t�tram�re. Les t�tram�res s’associent � leur tour pour former un protofilament. Une paire de protofilaments forme une protofibrille et quatre protofibrilles forment un filament dont la structure ressemble � celle d’une corde tress�e.

Figure 1.4 : Diagramme en ruban montrant la structure enroul�e des deux h�lices α constituant l’unit� structurelle des filaments interm�diaires.103 Les filaments interm�diaires sont g�n�ralement localis�s autour de la membrane nucl�aire des cellules. Ils constituent � peu pr�s 1% de la quantit� totale de prot�ine de la plupart des cellules exceptions faites des neurones et des k�ratinocytes qui en contiennent plus de 85 %. Il a �t� observ� que les cellules �pith�liales du sein normales et canc�reuses exprimaient diff�remment la k�ratine qui est une des prot�ines formant

19

les filaments interm�diaires.112 La tableau 1.3 pr�sente quelques valeurs de module de Young pour diff�rents mat�riaux contenant de la k�ratine (constituant les filaments interm�diaires de type I) Tableau 1.3 Module de Young k�ratine
113

de diff�rents mat�riaux contenant de la Module de Young (sec) (GPa) 6.8 3.5 5.6 2.3 0.19 Module de Young (humide) (GPa) 2.4 0.1 2.0 1.5 0.13

Mat�riau Poil de cheval Poil de cheval Laine de mouton Ongle Peau

Direction Longitudinale Transversale Longitudinale Longitudinale Longitudinale

1.2.2 Approches exp�rimentales pour mesurer les propri�t�s m�caniques d’une cellule Un grand nombre de techniques exp�rimentales ont �t� d�velopp�es pour mesurer les propri�t�s m�caniques des cellules. Ces techniques peuvent �tre class�es en trois grandes cat�gories : dans la premi�re cat�gorie se trouvent les techniques mesurant les propri�t�s m�caniques locales de la cellule. Les techniques les plus utilis�es pour ce type de mesure sont l’AFM, la cyto indentation et la Magnetic Twisting Cytometry (MTC). La seconde cat�gorie de mesures consiste � d�former la cellule dans sa totalit�. Dans cette cat�gorie se trouvent les techniques des pinces optiques, la micro-�tireuse, l’aspiration par micropipette et la technique de d�formation de micro-pyl�nes. La troisi�me cat�gorie regroupe les techniques d�formant simultan�ment une large population de cellules. On compte dans cette cat�gorie les techniques de l’�tirement de substrat et du cisaillement par courant laminaire. Toutes ces techniques sont bri�vement sch�matis�es � la Figure 1.5.

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a

b

c

AFM
d e

MTC
f

Cyto indentation
g

Micropipette
h

Pinces Optiques

Micro �tireuse
i

R�seau de pil�nes

Cisaillement Laminaire

Etirement du substrat

Figure 1.5 : Repr�sentation sch�matique des diff�rentes techniques utilis�es pour mesurer les propri�t�s m�caniques cellulaires. Les techniques sont class�es en trois cat�gories suivant l’�tendue de la d�formation cellulaire qu’elles g�n�rent. (a-c) : d�formation locale de la cellule ; (d-g) : d�formation de toute la cellule ; (h-i) : d�formation d’un ensemble de cellules. L’AFM114-116 d�forme localement la membrane cellulaire en appliquant une force gr�ce � une pointe conique support�e � l’extr�mit� d’un levier actionn�. La d�flection du levier peut �tre calibr�e pour conna�tre la force appliqu�e. Un des principaux d�savantages de cette technique r�side dans le fait que les fortes pressions appliqu�es localement sur la cellule peuvent affecter ses propri�t�s et sa viabilit�. La magn�to cytom�trie de cisaillement (� Magnetic Twisting Cytometry �, MTC)117-119 consiste � animer une bille ferromagn�tique attach�e � la cellule � l’aide d’un champ magn�tique. Une partie de la membrane cellulaire est d�form�e par le mouvement de la particule induit par le champ magn�tique. Le d�placement de la particule est mesur� par vid�o microscopie. Cette technique requiert une approximation de l’aire de contact entre la bille magn�tique et la cellule afin de pouvoir estimer l’effort appliqu� sur la membrane cellulaire. La cyto indentation116,
120

consiste � appliquer une d�formation

21

locale � la cellule � l’aide d’une pointe d’indentation de g�om�trie connue. La force appliqu�e est mesur�e par des jauges de contraintes plac�es au dessus de l’indenteur. La d�formation est estim�e par microscopie. Le principal d�savantage de cette technique est identique � celui de l’AFM c'est-�-dire que de fortes pressions sont appliqu�es localement sur la paroi cellulaire. Ces trois techniques permettent d’appliquer des forces de l’ordre de 10-12-10-6 N et des d�placements de l’ordre de 1 nm. Les pinces optiques121-123 ont �t� utilis�es pour mesurer les propri�t�s m�caniques des cellules sous une d�formation par traction. Deux billes microm�triques sont coll�es sur les deux extr�mit�s de la cellule et celles-ci sont d�plac�es � l’aide des pinces. La d�formation totale de la cellule est visualis�e par microscopie et l’analyse de la forme de la cellule permet de mesurer ses propri�t�s �lastiques � l’aide d’une mod�lisation par �l�ments finis. Cette technique se limite � l’�tude des cellules non adh�rentes. La mesure par micro-�tireuse124-126 consiste � coller une cellule entre deux micro-plateaux et � �tirer la cellule en d�pla�ant le plateau sup�rieur. Le d�placement et la flexion du plateau mobile sont analys�s par microscopie. Le principal probl�me de cette technique est que l’aire de contact entre la cellule et les plateaux ne reste pas constante durant l’�tirement ce qui complique la mesure de force. La mesure par d�formation d’un r�seau de micro-pyl�nes116, 127 consiste � d�poser une cellule sur un r�seau de micro-pyl�nes d�formables et adh�sifs. La cellule, en s’attachant aux pyl�nes qui la supportent, va les d�former en exer�ant sur eux une force de traction. La d�formation de chacun des pyl�nes est mesur�e par analyse d’image. Les substrats utilis�s dans ce type d’exp�rience �tant fortement accident�s, les cellules adoptent sur leur surface une configuration peu naturelle qui peut alt�rer leurs propri�t�s m�caniques. La mesure par aspiration par micropipette128,
129

consiste � aspirer une

cellule � l’aide d’une micropipette de diam�tre connu. La mesure de la d�pression n�cessaire pour aspirer partiellement la cellule ainsi que sa longueur de p�n�tration dans la micropipette permettent de d�terminer le module �lastique de la membrane cellulaire. Cette technique s’applique principalement aux cellules non adh�sives et n�glige la friction entre la micropipette et la cellule. Les forces appliqu�es par ces diff�rentes techniques varient entre 10-12 et 10-7 N et sont appliqu�es sur la cellule dans son ensemble.

22

La mesure de cytoadh�rence consiste � d�poser les cellules dans une chambre � flux et � faire passer un d�bit de liquide relativement faible de sorte que le flux soit laminaire. En faisant varier le d�bit, il est possible de faire varier l’effort cisaillant s’appliquant sur les cellules et de d�tecter entre autre leur seuil de d�tachement.130 Cette technique ne mesure pas les propri�t�s m�caniques de la cellule mais la r�sistance au cisaillement dans des conditions tr�s proches du vivant. La mesure de l’adh�sion et la d�formation cellulaire par �tirement de substrat131, 132 consiste � d�poser les cellules sur un substrat �lastique trait� (de silicone par exemple) et � l’�tirer. L’effet de l’effort sur la morphologie cellulaire, le ph�notype et la viabilit� peuvent �tre ainsi �tudi�s. Cet test vise � observer la r�ponse dynamique de cellules soumises � un stress mais ne permet pas de d�terminer directement leurs propri�t�s m�caniques. Ces techniques appliquent des efforts cisaillants variant de 10-2 � 10-4 N. Aucune �tude sur la mesure des propri�t�s m�caniques d’un ensemble de cellules n’a �t� report�e. De telles �tudes pourraient grandement aider la caract�risation in vitro de tissus cellulaires dans des conditions proches du vivant. 1.2.3 Mod�lisations des propri�t�s m�caniques des cellules vivantes Une vue g�n�rale des diff�rentes approches utilis�es pour mod�liser les propri�t�s m�caniques des cellules est sch�matis�e � la Figure 1.6. Ces mod�les sont obtenus soit en utilisant l’approche micro/nanostructurale soit l’approche continue. La premi�re approche consid�re le cytosquelette comme le composant structural le plus important et a �t� d�velopp� pour �tudier sp�cifiquement les propri�t�s m�caniques du cytosquelette des cellules adh�rentes.133-135 Pour les cellules suspendues comme les �rythrocytes, le mod�le du r�seau de spectrine est utilis� pour d�terminer les contributions respectives de la membrane et du r�seau de spectrine sur la d�formation des globules rouges.135, 136 Une autre approche consiste � traiter les cellules comme un mat�riau poss�dant certaines propri�t�s m�caniques continues. A partir d’observations exp�rimentales, les lois constitutives du mat�riau et leurs param�tres associ�s sont obtenus. Bien que cette approche procure moins d’information � l’�chelle mol�culaire, elle est plus simple � utiliser pour extraire les propri�t�s m�caniques de la cellule toute enti�re.

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Mod�les M�caniques des Cellules Vivantes

Approche Continue

Approche Micro/Nanostructurale

Mod�les Visco�lastiques

Mod�les Biphasiques Mod�les du cytosquelette pour cellules adh�rentes

Membrane corticale-Cœur liquide (mod�les de la goutte liquide) Mod�les du Solide

•Mod�le de tens�grit� •R�seau de c�bles tendus
Mod�les du R�seau de Spectrine pour les �rythrocytes

•ELastique •Visco�lastique
Mod�le D�rivatif Fractionnel

•Amortissement de structure
en loi de puissance

Figure 1.6 : Repr�sentation g�n�rale des mod�les m�caniques des cellules vivantes Le mod�le de la goutte liquide fut d�velopp� par Yeung et al.137 pour d�crire la d�formation d’une cellule aspir�e par une micropipette. Dans ce mod�le, l’int�rieur de la cellule est consid�r� comme un fluide newtonien et le cortex cellulaire comme une membrane fluide poss�dant une tension statique mais aucune r�sistance � la flexion. En utilisant ce mod�le, les auteurs ont pu montrer que la dissipation dans la membrane corticale est tr�s largement n�gligeable par rapport � celle du liquide intracellulaire. Ce mod�le pr�dit aussi une relation lin�aire entre la vitesse de d�formation et le rayon cellulaire hors de la pipette. Cette relation a �t� confirm�e exp�rimentalement avec des neutrophiles.138 De mani�re g�n�rale, ce mod�le permet de repr�senter les propri�t�s m�caniques des cellules non adh�rentes soumises � de larges d�formations (80-120 %). La viscosit� du cytoplasme obtenue par ce mod�le varie entre 100-200 Pa.s et la tension de surface de la membrane corticale entre 0.02-0.04 � 10-3 N/m. Une version �volu�e du mod�le consiste � inclure les propri�t�s m�caniques du noyau en le mod�lisant comme une seconde capsule baignant dans la cellule. Cette capsule est constitu�e d’un

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fluide newtonien plus visqueux que le cytoplasme et d’une membrane �lastique.139 Ce mod�le a permis entre autre de pr�dire que la viscosit� nucl�aire est en moyenne 10 fois sup�rieure � celle du cytoplasme. Malheureusement, ce mod�le poss�de plusieurs param�tres variables ce qui le rend souvent peu pratique et peu fiable dans des configurations plus complexes que l’aspiration par micropipette. Le mod�le de la goutte liquide ne tient pas compte de certaines propri�t�s m�caniques observ�es sur un grand nombre de cellules non adh�rentes comme l’augmentation de la viscosit� cytoplasmique avec la vitesse de cisaillement. Ceci peut �tre corrig� en consid�rant le cytoplasme non plus comme un fluide newtonien mais comme un fluide � loi de puissance, c'est-�-dire un fluide dont la viscosit� augmente exponentiellement avec la vitesse de cisaillement.140 D’autres techniques comme la MTC ont �t� utilis�es sans succ�s pour corroborer l’hypoth�se du fluide � loi de puissance.117 Les r�sultats obtenus sur des neutrophiles par aspiration de micropipette prouvent que ce mod�le est valide aux larges d�formations mais que la d�pendance en loi de puissance dispara�t � faible vitesse de cisaillement. Une autre approche consid�re cette fois-ci le cytoplasme comme un fluide visco�lastique de Maxwell. L’inclusion d’une composante �lastique pour mod�liser les propri�t�s rh�ologiques du cytoplasme a permis de reproduire un certain nombre de r�sultats exp�rimentaux obtenus par la m�thode d’aspiration par micropipette comme par exemple l’�volution du temps de r�cup�ration en fonction du temps de d�formation.141 Les mod�les que nous venons de d�crire ne permettent pas d’expliquer les propri�t�s m�caniques de tous les types de cellules. Par exemple, les cellules endoth�liales et les chondrocytes ne peuvent pas �tre aspir�es par une micropipette ce qui sugg�re qu’ils poss�dent un comportement de solide �lastique.142,
143

Les mod�les d�velopp�s pour

prendre en compte ce comportement consid�rent la cellule comme un solide �lastique ou visco�lastique homog�ne sans membrane corticale. Le mod�le de la cellule purement �lastique a �t� d�velopp� pour diff�rentes techniques comme la micropipette,142 l’AFM,144 la cytoindentation145 et la MTC.146 Le mod�le du solide visco�lastique a lui aussi �t� d�velopp� pour les m�me techniques.147 Bien que ces

25

mod�les aient �t� d’abord d�velopp�s pour �tudier les propri�t�s m�caniques des leucocytes, il s’est av�r� que ces cellules sont mieux repr�sent�es par le mod�le de la goutte liquide d�crit pr�c�demment. Par contre, plusieurs cellules adh�rentes comme les cellules endoth�liales ou m�me le noyau cellulaire d�montrent un comportement de solide �lastique. Les mod�les d�crits pr�c�demment sont dits statiques car ils d�crivent la d�formation de la cellule soumise � une d�formation instantan�e. Cependant les cellules sont fr�quemment soumises � des forces dynamiques dans leur environnement physiologique. Un des mod�les dynamiques pouvant reproduire ce type de sollicitation m�canique est le mod�le d’amortissement de structure en loi de puissance d�velopp� par Fabry et coll. 133 Il a �t� valid� par la technique de MTC148, 149 et par AFM.150, 151 Il a �t� d�montr� que le module �lastique d’un grand nombre de lign�es cellulaires d�pendait de la fr�quence d’oscillation selon une loi de puissance. Pour des fr�quences comprises entre 0.01 et 103 Hz, l’exposant de la loi de puissance varie entre 0.1 et 0.4. Pour des fr�quences plus �lev�es, la composante visqueuse devient majoritaire.117, 149,
151

Ce comportement rh�ologique est parfaitement captur� par le mod�le

d’amortissement de structure d�velopp� par Fabry et al.149 1.2.4 Implications du cytosquelette dans l’adh�sion cellulaire et l’endocytose L’adh�sion cellulaire et le cytosquelette L’adh�sion entre la cellule et la matrice extra cellulaire (MEC) se fait par l’interm�diaire des int�grines qui sont des prot�ines transmembranaires interagissant � l’int�rieur de la cellule avec le cytosquelette. Les int�grines interagissent en plus avec diff�rents types de ligands pr�sents dans la MEC comme la fibronectine, la vitronectine et diff�rents types de collag�ne. L’adh�sion entre la cellule et la MEC se caract�rise par l’apparition de diff�rentes structures adh�sives localis�es spatialement et temporellement. On compte parmi elles les sites d’adh�sion focale (ou aussi appel�s contacts focaux), les jonctions fibrillaires, les complexes focaux et les podosomes. Le contact focal est une structure plane et allong�e de plusieurs microm�tres carr� de surface et localis�e � la p�riph�rie des cellules.152-154 Les contacts focaux, en plus de

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permettre � la cellule d’adh�rer fortement au substrat, sont le point d’ancrage de bouquets de filaments d’actine. L’ancrage des filaments d’actine sur le contact focal regroupe un grand nombre de prot�ines constituant la plaque adh�sive. On compte plus de 50 prot�ines diff�rentes constituant la plaque adh�sive dont les plus �tudi�es sont la taline, la vinculine et la paxiline. Les contact focaux sont issus de la maturation et la stabilisation des complexes focaux. Le complexe focal fait r�f�rence � une petite structure ponctuelle pr�sente essentiellement � la p�riph�rie du lamellipodium.155,
156

Ces sites d’adh�sion sont associ�s � la migration cellulaire et servent aussi de pr�curseurs aux contacts focaux. L’apparition d’un complexe focal d�bute par l’agr�gation de plusieurs int�grines pour former le complexe. Celui-ci pourra dispara�tre ou m�rir pour former un contact focal d’adh�sion. Le processus de maturation peut �tre activ� de mani�re interne par la machine contractile de la cellule157,
158

ou bien de mani�re externe en appliquant une force externe sur la cellule.159,

160

L’ajout d’inhibiteurs de la contractilit� actomyosinale produit une perte rapide des contacts focaux d’adh�sion.161 Les jonctions fibrillaires, aussi appel�es contacts adh�sifs fibrillaires, se situent le plus souvent au centre de la cellule et sont tr�s allong�es.162-164 Cette structure est souvent associ�e � la structure de la MEC sous jacente. Les principaux compos�s des jonctions fibrillaires sont la fibronectine du c�t� de la MEC, l’int�grine α5β1 et la tensine du c�t� cellulaire. Les podosomes sont de toutes petites structures cylindriques d’environ 500 nm de diam�tre contenant principalement de la paxiline et vinculine. Leur formation est conditionn�e � la pr�sence de dynamine et de gelsonine.165, 166 Une particularit� remarquable des prot�ines formant les contact adh�sifs est qu’elles sont capables d’interagir avec un grand nombre de partenaires. Par exemple la paxiline peut interagir avec plus de 10 prot�ines diff�rentes dont les int�grines ce qui rend le nombre de combinaisons d’interactions mol�culaires liant l’int�grine au cytosquelette incroyablement �lev�. La m�canique des int�grines et les voies de signalisation qui leurs sont associ�es permettent aux cellules de r�guler la composition et la structure de la plaque adh�sive.

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Le cytosquelette et l’endocytose L’endocytose repr�sente les diff�rentes voies par lesquelles la cellule � sonde � le milieu ext�rieur en y pr�levant de petites quantit�s qu’elle � trie et dig�re � dans des v�sicules intracellulaires. Ce proc�d� est fondamental pour le contr�le de divers processus physiologiques comme la signalisation hormonale, la surveillance immunitaire, la pr�sentation des antig�nes et l’hom�ostasie cellulaire. On distingue trois modalit�s pour l’endocytose, suivant le type d’interaction par laquelle le mat�riel extracellulaire est int�rioris� : l’endocytose en phase fluide, l’endocytose adsorptive non sp�cifique et l’endocytose m�di�e par r�cepteurs. La capture de solut�s par endocytose en phase fluide est tr�s faible, ne d�pend pas de la nature du traceur et son efficacit� est strictement proportionnelle � la concentration des traceurs dans le milieu extracellulaire. L’endocytose fluide n’est pas associ�e sp�cifiquement � une structure particuli�re, mais regroupe tous les types de structures endocytaires, � l’exception des phagosomes o� la membrane limitante, �troitement accol�e � la paroi, ne laisse pas de place pour l’endocytose fluide. L’endocytose adsorptive a lieu lorsqu’un solut� particulier peut s’adsorber sur une population g�n�ralement abondante de sites non sp�cifiques sur la membrane p�ricellulaire, par interactions �lectrostatiques, par formation de liaisons hydrog�ne ou par interactions hydrophobes. L’efficacit� de la capture d’un traceur par endocytose adsorptive d�pend de l’abondance des sites de fixation et de l’avidit� du traceur pour ces sites. L’efficacit� varie donc en fonction du type cellulaire et de la nature du traceur. La diversit� des sites de liaison impliqu�s exclut une r�gulation s�lective de l’endocytose adsorptive. Pour un traceur donn� fortement adsorb�, la contribution relative de l’endocytose adsorptive est sup�rieure � celle de l’endocytose fluide. En revanche, si l’avidit� de la membrane pour le traceur est faible, la composante adsorptive de l’endocytose est n�gligeable par rapport � la composante fluide. L’endocytose m�di�e par des r�cepteurs implique la liaison sp�cifique, g�n�ralement de haute affinit�, entre des ligands bien d�finis et un nombre limit� de r�cepteurs transmembranaires expos�s � la surface cellulaire. Ces complexes ligands-r�cepteurs se concentrent dans les puits mantel�s et p�n�trent dans des v�sicules mantel�es (recouvertes de clathrine). Les ligands se concentrent au niveau de la membrane

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plasmique o� ils s’associent � leurs r�cepteurs et au niveau des puits mantel�s o� l’adaptine de type AP2 entra�ne la polym�risation du manteau de clathrine � la membrane plasmique. Cette polym�risation pi�ge les complexes ligands-r�cepteurs sur une surface tr�s restreinte de la membrane p�ricellulaire o� a lieu l’endocytose. Au contraire de l’endocytose fluide, l’endocytose m�di�e par r�cepteurs est caract�ristique d’un seul type de v�sicules endocytaires primaires, les v�sicules recouvertes de clathrine. L’endocytose li�e aux r�cepteurs est le m�canisme le plus efficace pour la capture s�lective de macromol�cules pr�sentes en faible concentration dans le milieu extracellulaire. Cette capture peut �tre finement r�gul�e en contr�lant le nombre de r�cepteurs exprim�s, de leur fraction expos�e en surface et/ou de l’affinit� de l’interaction entre le ligand et le r�cepteur. L’endocytose regroupe diff�rentes voies d’internalisation. La phagocytose est r�alis�e par les cellules sp�cialis�es comme les macrophages, les monocytes ou les neutrophiles qui ont tous pour fonctions de d�tecter et d’�liminer les pathog�nes telles que les bact�ries ou les levures. Ce processus est hautement r�gul� et implique des r�cepteurs cellulaires sp�cifiques.167 Par exemple, les r�cepteurs Fc pr�sents sur les macrophages sont activ�s par les anticorps li�s aux antig�nes des bact�ries. Une cascade de signalisation d�clenche l’assemblage et la formation de protub�rances qui s’enroulent autour du pathog�ne recouvert d’anticorps. Suivent ensuite d’autres cascades de signaux servant � d�truire l’�l�ment ingurgit�. La macropinocytose prend naissance au niveau de la r�gion marginale de la cellule riche en actine corticale polym�ris�e. Elle s’amorce par de fortes ondulations membranaires (dites � ruffling �) qui produisent des feuillets amincis en protusions vers l’ext�rieur de la cellule. Ces feuillets se prolongent puis se referment contre la membrane plasmique, g�n�rant ainsi des macropinosomes (Figure 1.7 3a-c).168 Les macropinosomes sont de taille irr�guli�re et peuvent d�passer 10 μm de diam�tre. La macropinocytose est limit�e � certains types cellulaires. Elle peut �tre induite en quelques minutes mais de mani�re transitoire par les esters de phorbol (agents promoteurs de tumeurs) et par les facteurs de croissance qui stimulent la mitose et/ou pr�viennent l'apoptose.169 L’actine est impliqu�e dans la formation des protusions membranaires et leur fermeture pour former les macropinosomes (Figure 1.7 3a). Son

29

r�le semble �tre similaire � celui qu’elle joue durant l’extension du lamellipode car les appareillages prot�iques impliqu�s dans ce ph�nom�ne et la macropinocytose sont tr�s similaires.170, 171 De plus, une tra�n�e de filaments d’actine peu stables dans le temps est observ�e en queue des pinosomes r�cemment form�s. La polym�risation de l’actine propulse la v�sicule dans le cytoplasme � une vitesse d’approximativement 200 nm/s durant quelques dizaines de secondes.171 La pr�sence de dynamine dans la tra�n�e de filaments d’actine sugg�re que cette prot�ine joue un r�le important lors de la fermeture de la v�sicule.172 La pinocytose fait r�f�rence au m�canisme donnant naissance � des v�sicules endocytaires de petite taille (typiquement inf�rieures � 200 nm de diam�tre) qui peuvent �tre ou non tapiss�es d’un manteau de clathrine. Elle regroupe trois types de m�canisme : la voie des clathrines, la voie cav�olaire et es voies alternatives (clathrine et caveolae ind�pendantes) La voie des clathrines d�signe la formation des v�sicules tapiss�es d’un manteau de clathrine. C’est le processus qui assure l’endocytose m�di�e par r�cepteurs, permettant � la cellule de concentrer puis d’internaliser de mani�re sp�cifique des ligands extracellulaires tout en minimisant l’endocytose fluide concomitante oblig�e.173, 174 La pinocytose associ�e � la clathrine est constitutive dans tous les types cellulaires. Les puits mantel�s de clathrine occupent environ 2 % de la surface de la membrane plasmique. La dur�e de vie de ces invaginations est courte, dans la minute qui suit leur formation, les invaginations se d�tachent par pincement pour donner naissance � des v�sicules recouvertes d’un manteau de clathrine (Figure 1.7 1a-c).

30

3 1 Voie des clathrines Macropinocytose 2 Voie cav�olaire

1a

2a

3a

1b

2b

3b

1c

2c

3c Caveolae

et/ou 1c’

Clathrines Dynamine F-actine

Figure 1.7 : Repr�sentation sch�matique des diff�rentes fonctions de l’actine dans les diff�rentes voies d’endocytose. L’actine sert d’�chafaudage pour la formation des invaginations couvertes par la clathrine ou la caveoline (1a et 1b), elle produit la force motrice pour la maturation et la scission des invaginations (1b, 1c et 2b) puis finalement elle propulse les v�sicules form�es dans chacune des voies loin de la membrane plasmatique (1c’, 2c et 3c). L’actine joue aussi un r�le important dans la formation des protub�rances membranaires lors de la formation des v�sicules macropinocytiques (3a). La dynamine joue un r�le pr�pond�rant dans cette �tape en permettant la scission du col v�siculaire.175 Tr�s rapidement, ces v�sicules perdent leur manteau et sont alors capables de fusionner avec les endosomes pr�coces. Plusieurs prot�ines de la membrane plasmatique sont impliqu�es dans la machinerie endocytique des puits 31

mantel�s, tels que l’adaptateur AP2 et ses partenaires directs (comme l’amphiphysine) ou indirects (comme la dynamine). L’actine r�alise diverses fonctions durant la pinocytose associ�e � la clathrine. Elle joue le r�le d’�chafaudage pour l’assemblage et l’ancrage de la machinerie endocytique durant la formation des puits mantel�s. Elle d�termine aussi l’endroit pr�cis ou apparaissent les puits mantel�s sur la membrane plasmatique.176 La localisation de la machinerie endocytique sur certains sites de la membrane plasmatique est tr�s importante pour l’organisation du cortex cellulaire et pour maintenir la polarit� cellulaire. Cette fonction est primordiale pour les cellules neuronales ou �pith�liales pour lesquelles les marqueurs doivent �tre internalis�s � des sites particuliers de la membrane plasmatique. La polym�risation de l’actine permet de g�n�rer l’�nergie m�canique suffisante durant la constriction et la scission des v�sicules mantel�es (Figure 1.7 1b-c).177 Une fois form�es, les v�sicules sont �loign�es de la membrane plasmatique. Ce processus est r�alis� en partie par la polym�risation de l’actine qui propulse les v�sicules mantel�es (Figure 1.7 1c’). Une forme particuli�re d’endocytose ind�pendante de la clathrine implique les cav�oles. Il s’agit d’invaginations membranaires de tr�s petite taille (60 nm de diam�tre) recouvertes sur leur face cytoplasmique d’un manteau spiral� form� de cav�oline. Cette prot�ine est capable de s’ins�rer profond�ment dans la membrane et d’y stabiliser des microdomaines riches en cholest�rol. L’existence des cav�oles a �t� initialement observ�e dans les cellules endoth�liales, les adipocytes et les cellules musculaires lisses, mais on les trouve dans presque toutes les cellules hormis les lymphocytes. Le cholest�rol est n�cessaire � la formation des cav�oles. En effet, la fonction des cav�oles est inhib�e par la d�pl�tion en cholest�rol ou par le traitement � la filipine, qui complexe le cholest�rol.178 Les cav�oles sont caract�ris�es par leur insolubilit� dans le triton X-100 � 4�C et leur tr�s faible densit� en gradient de flottation. Le r�le des cav�oles dans l’endocytose reste incertain. Initialement, ces structures ont �t� impliqu�es dans le transport de solut�s � travers les cellules endoth�liales et dans le ph�nom�ne de transcytose.179

32

Le m�canisme de formation des cav�oles pr�sente certaines similarit�s avec celui des v�sicules associ�es � la clathrine. La localisation des sites de formation des cav�oles semble �tre strictement contr�l�e par l’actine. Celle-ci joue le r�le d’�chafaudage limitant la mobilit� des puits cav�olaires.180,
181

La dynamine joue aussi le r�le de

constriction et de scission du puit v�siculaire bien que son recrutement semble �tre r�gul�. Lors du recrutement de la dynamine, l’actine s’associe temporellement � la cav�oline pour former des fibres et des plaques associ�es � la v�sicule (Figure 1.7 1b). La polym�risation de l’actine laisse une tra�n�e de plusieurs microm�tres de long et propulse la v�sicule � l’une de ses extr�mit�s. Ce m�canisme est tr�s similaire � celui rencontr� dans la voie des clathrines bien que la tra�n�e associ�e aux cav�oles soit plus longue et plus stable dans le temps que celle associ�e aux v�sicules mantel�es de clathrine. Les caveolae repr�sentent un type de microdomaines de la membrane plasmatique riche en cholest�rol. Il existe d’autres microdomaines, appel�s � rafts � lipidiques, qui diffusent librement � la surface cellulaire. Leur composition lipidique unique permet de s�gr�guer certaines prot�ines membranaires et / ou certains glycolipides par leur r�gion transmembranaire.182, 183 Ces domaines peuvent en principe �tre captur�s et internalis�s par n’importe quel type de v�sicule endocytique. Les m�canismes sous-jacents � cette voie d’internalisation alternative sont tr�s peu connus jusqu'� ce jour.

1.3 Hypoth�ses et objectifs
L’objectif principal de cette th�se est d’�tudier l’impact de certains param�tres physicochimiques sur l’interaction entre des nanoparticules polym�riques et des cellules vivantes. Trois param�tres ont �t� �tudi�s : (i) effet du greffage d’une mol�cule active � la surface des nanoparticules pour cibler l’endoth�lium, (ii) effet des propri�t�s m�caniques des cellules sur leur capacit� d’internalisation des nanoparticules, (iii) effet des propri�t�s m�caniques des nanoparticules sur leur capacit� de p�n�tration cellulaire.

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Effet du greffage d’une mol�cule active pour le ciblage de l’endoth�lium Le ciblage de l’endoth�lium repr�sente une voie de lib�ration des principes actifs tr�s int�ressante pour les pathologies ayant une composante inflammatoire prononc�e. Les strat�gies qui ont �t� report�es jusqu'� aujourd’hui utilisent des nanoparticules fonctionnalis�es en surface avec un ligand ciblant soit l’int�grine ICAM-1 soit les s�lectines E et P. Dans le cas des s�lectines, le ligand le plus utilis� est le sialyl Lewisx, pr�sent sur la membrane externe des neutrophiles. Ce ligand �tant naturellement pr�sent dans le corps humain, son utilisation comme mol�cule active sur un vecteur ne garantit pas un ciblage efficace car des nanoparticules fonctionnalis�es avec ce ligand seront automatiquement en comp�tition avec les autres formes de ligands pr�sentes dans le flux sanguin. Nous proposons donc de d�velopper un nouveau syst�me de transport de m�dicament bas� sur des particules d’acide polylactique fonctionnalis�es avec un nouveau ligand synth�tique. Afin de garantir la pr�sence du ligand tout au long de la dur�e de vie du vecteur, il sera n�cessaire de concevoir une nouvelle strat�gie de couplage du ligand avec le cargo. Pour ce faire la particule sera compos�e de deux polym�res dont l’un poss�dera le ligand greff�. Ainsi une fraction du ligand greff� sera expos�e sur la surface de la nanoparticule tandis que la fraction restante sera prot�g�e � l’int�rieur de la nanoparticule et sera exhib�e plus tardivement par �rosion de la nanoparticule. Afin de d�montrer que ce vecteur est capable de cibler l’endoth�lium des �tudes ont �t� r�alis�es in vitro sur des cellules endoth�liales activ�es avec diff�rents m�dicaments afin de simuler diff�rentes conditions pathologiques et de v�rifier l’efficacit� du vecteur. En cas de r�ussite, ces r�sultats devrait poser les bases n�cessaires pour de futurs tests in vivo. Effet des propri�t�s m�caniques cellulaires sur leur capacit� � capter des nanoparticules Il est connu que les propri�t�s m�caniques du substrat sur lequel sont d�pos�es les cellules ainsi que la densit� de ligand pr�sente sur le substrat peut influencer

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l’internalisation des vecteurs nanoparticulaires. Il est donc concevable que les propri�t�s m�caniques du cytosquelette et l’adh�sion cellulaire soient impliqu�es dans l’interaction d’une cellule avec un vecteur nanoparticulaire. Cette hypoth�se sera v�rifi�e en �tudiant l’affinit� de nanoparticules de PLA avec des macrophages murins d�pos�s sur diff�rents substrats fonctionnalis�s capables de modifier les propri�t�s m�caniques et adh�sives des cellules. Les propri�t�s m�caniques et adh�sives des cellules seront mesur�es simultan�ment en utilisant une nouvelle m�thode. Effet des propri�t�s m�caniques des nanoparticules sur leur capacit� de p�n�tration cellulaire �tant donn� que les cellules modifient leur comportement biologique en fonction de l’�lasticit� du substrat sur lequel elles reposent, il est propos� que les propri�t�s m�caniques des nanoparticules doivent aussi avoir un impact sur leur capacit� � p�n�trer une cellule. Cette hypoth�se sera v�rifi�e en �tudiant l’effet de l’�lasticit� de nanoparticules d’hydrogel sur leur capacit� d’internalisation par des macrophages. Pour ce faire, des nanoparticules aux propri�t�s m�caniques contr�l�es ont �t� pr�par�es et leur internalisation et trafic intracellulaire ont �t� �tudi�s.

1.5 Structure de la th�se
La th�se est constitu�e de trois articles dont deux ont �t� accept�s et publi�s et un troisi�me est en cours de r�vision au moment ou cette th�se est �crite. L’objectif de cette th�se �tant d’�tudier l’impact des propri�t�s physico chimiques des NPs sur leur interaction avec les cellules, nous avons divis� la th�se en trois parties, chacune d’entre elle correspondant � un article qui a �t� publi� ou qui est en cours de r�vision. Dans le chapitre 3, nous �tudions l’effet de la modification des propri�t�s de surface des NPs sur leur propri�t� adh�sive. Les particules �tudi�es sont des particules de PLA sur lesquelles est greff� un ligand synth�tique des selectines. Cette �tude a fait l’objet d’une publication dans Bioconjugate Chemistry et peut �tre trouv�e sous la r�f�rence : � Selectin Ligand Decorated Drug Carriers for Activated Endothelial Cell

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Targeting � Xavier Banquy, Gr�goire Leclair, Jean-Michel Rabanel, Anteneh Argaw, Jean-Fran�ois Bouchard, Patrice Hildgen and Suzanne Giasson Bioconjugate Chemistry 19, 2030-2039, 2008. Dans le chapitre 4 nous �tudions cette fois-ci l’effet des propri�t�s m�caniques des cellules sur l’interaction NPs-cellules. Pour contr�ler les propri�t�s m�caniques des cellules nous avons d�velopp� diff�rents substrats capables d’alt�rer la structure du cytosquelette de la cellule modifiant ainsi son �lasticit�. Cette �tude a fait l’objet d’un article qui a �t� publi� sous le titre : � Direct Measurement of Mechanical and Adhesive Properties of Living Cells using Surface Forces Apparatus � Xavier Banquy, Jean-Michel Rabanel, Patrice Hildgen and Suzanne Giasson. Australian Journal of Chemistry 60 (9): 638-645, 2007. Le cinqui�me chapitre traite de l’effet des propri�t�s m�caniques des particules sur l’interaction NPs-cellules. Pour ce faire nous avons utilis� des NPs d’hydrogel r�ticul�es afin de contr�ler leur �lasticit�. Cette �tude a fait l’objet d’une troisi�me publication intitul�e � Correlations between mechanical properties of hydrogel nanoparticles and their uptake by macrophage cells � Xavier Banquy, Fernando Suarez, Anteneh Argaw, Jean-Michel Rabanel, Peter Gr�tter, Jean-Francois Bouchard, Patrice Hildgen, and Suzanne Giasson Soft Matter, DOI:10.1039/B821583A. Le sixi�me et dernier chapitre discute de la port�e g�n�rale des r�sultats obtenus dans les diff�rentes �tudes et pr�sente certaines voies possibles de recherche.

1.6 R�f�rences
1. 2. 3. 4. Schwope, A. D.; Wise, D. L.; Howes, J. F., Lactic-Glycolic Acid Polymers as Couvreur, P.; Tulkens, P.; Roland, M.; Trouet, A.; Speiser, P., Nanocapsules Kreuter, J., Nanoparticles and Nanocapsules - New Dosage Forms in Nanometer Gould, P. L.; Holland, S. J.; Tighe, B. J., Polymers for Biodegradable Medical

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CHAPITRE 2 TECHNIQUES EXPERIMENTALES

2.1 La mesure des forces d’interaction entre surfaces
2.1.1 Principe de la mesure Il existe un certain nombre de techniques capables de mesurer les forces d’interaction entre deux surfaces plac�es face � face. Ces techniques partagent des points communs dans leur principe de mesure. La Figure 2.1 repr�sente un sch�ma g�n�ral d’un syst�me de mesure de forces d’interaction entre une surface mobile support�e par un bras de levier et un substrat. Les principaux param�tres qui peuvent �tre mesur�s par ces syst�mes exp�rimentaux sont : la force d’interaction F, la distance de s�paration entre les surfaces D, la variation de distance associ�e ΔD, le pas d’approche du bras de levier ΔD0, la d�flection du bras de levier ΔDc , la d�formation du substrat mou ΔDs , le module de compression normale du substrat mou Ks et la constante de raideur du bras de levier Kc. La majeure partie de ces param�tres peut �tre contr�l�e de mani�re ind�pendante et directement mesur�e exp�rimentalement. La mesure de la loi de force F(D) entre les deux surfaces, c'est-�-dire la force en fonction de la s�paration D, s’effectue de la mani�re suivante. Les surfaces sont s�par�es d’une distance D suffisamment grande de telle sorte que F(D) = 0 (ce qui correspond � un �tat de r�f�rence arbitraire). La base du levier de constante de raideur Kc est d�plac�e de ΔD0 (connue) vers une nouvelle position o� il existe un champ de force (attractif ou r�pulsif) entre les deux surfaces. Cette force est d�tect�e car elle cause la d�flection ΔDc du levier.

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F=KCΔDC D�flection du levier
Syst�me g�n�rateur de force externe (constante de raideur du levier, Kc)

ΔDC Ds

Ks ΔDs

Substrat mou Champ de force, F(D)

Ds+ΔDs (ΔDs=F/Ks) D0+ΔD0 D+ΔD

Substrat dur

Figure 2.1 : G�om�trie g�n�rale utilis�e pour la mesure des forces d’interaction entre deux surfaces ainsi que les param�tres importants qui doivent �tre contr�l�s et/ou mesur�s.

Elle provoque aussi la d�formation du substrat mou (ΔDs = F/Ks ). En m�me temps, la s�paration entre les deux surfaces change de ΔD pour se stabiliser � la nouvelle s�paration D+ΔD. La force d’interaction F(D) est donc : F(D) = KcΔDc d�formation du substrat connaissant F et Ks. L’�quation 2.1 permet de mesurer la force d’interaction, attractive ou r�pulsive, � une s�paration D quelconque. 2.1.2 Effet de la g�om�trie du syst�me et approximation de Derjaguin G�n�ralement, il est difficile de mesurer les forces entre deux surfaces planes car elles doivent �tre atomiquement planes et leur alignement parall�le doit �tre parfait. Il est donc beaucoup simple de mesurer les forces entre des surfaces courbes comme deux sph�res, une sph�re et un plan ou bien deux cylindres crois�s. La r�sultante des forces d’interaction Fc(D) entre deux surfaces courbes peut �tre directement reli�e � l’�nergie de surface Ep(D) mesur�e entre deux surfaces planes � la m�me distance de (2.1) La force d’interaction est aussi donn�e par F(D) = KsΔDs ce qui permet d’obtenir la

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s�paration D. Cette relation est connue sous le nom d’approximation de Derjaguin et s’�crit : Fc(D) = 2πREp(D) rayon moyen des cylindres (pour deux cylindres crois�s). Cette relation est tr�s importante d’un point de vue fondamental car elle permet de calculer simplement l’�nergie d’interaction entre deux corps ind�pendamment de leur g�om�trie. De mani�re g�n�rale, on reporte rarement F en tant que telle. Il est pr�f�rable de reporter F/R, c'est-�-dire Ep , pour que les r�sultats puissent �tre compar�s d’une technique � une autre ind�pendamment de la g�om�trie utilis�e. (2.3) O� R est le rayon de courbure de la sph�re (pour une g�om�trie sph�re-plan) ou bien le

2.2 L’appareil de forces de surface, Surface Force Apparatus SFA
Le SFA1-3 est la seule technique permettant la mesure directe de la force F, de la s�paration absolue D entre les deux surfaces et la visualisation simultan�e de la g�om�trie locale des deux surfaces en interaction. La distance de s�paration peut �tre mesur�e quantitativement avec une pr�cision de � 0.2 nm4. Les dimensions lat�rales ou l’aire de contact peuvent �tre mesur�es avec une r�solution de 1 μm seulement. Si l’on se r�f�re � la Figure 2.1, la technique du SFA peut �tre utilis�e pour mesurer directement D, ΔD, ΔD0, le rayon de l’aire de contact a, R (avec une pr�cision de �10%). Dans le SFA, repr�sent� sch�matiquement � la Figure 2.2, les surfaces sont mont�es sur deux substrats courbes qui peuvent �tre approch�s ou s�par�s de mani�re contr�l�e dans un intervalle allant de quelques millim�tres jusqu’au contact mol�culaire. Les vitesses d’approche et de s�paration peuvent �tre vari�es sur un intervalle de huit ordres de grandeur (de 1 mm.s-1 jusqu'� 0.1 nm.min-1). Les supports utilis�s sont des disques cylindriques de rayon R = 20 mm.

57

Syst�me de d�placement m�canique Analyse spectral de la lumi�re transmise

Surfaces de mica en g�om�trie cylindre crois�s

Lumi�re Visible

Figure 2.2 : Repr�sentation sch�matique du SFA (mod�le MK II). Un faisceau

de lumi�re visible p�n�tre dans la chambre de mesure et traverse deux cylindres crois�s sur lesquels sont d�pos�s des feuillets de mica. La lumi�re transmise est collect�e dans un spectrom�tre o� la longueur d’onde des franges d’interf�rence est mesur�e. La g�om�trie du contact et la distance de s�paration entre les surfaces sont d�termin�es � l’aide d’une technique d’interf�rom�trie optique. De la lumi�re blanche est envoy�e perpendiculairement aux deux surfaces et le faisceau transmis est collimat� sur la fente d’entr�e d’un spectrom�tre � r�seau. Des feuillets tr�s fins d’un mat�riau transparent tel que le mica, et argent�s sur leur face non expos�e au milieu ambiant, permettent l’obtention de r�flexions multiples du faisceau lumineux qui les traverse.4, 5 Apr�s diffraction par le r�seau du spectrom�tre, le patron des franges d’interf�rence, ou le spectrogramme peut �tre observ� au travers d’un oculaire positionn� en sortie du spectrom�tre ou � l’aide d’une cam�ra. Les franges color�es sont connues sous le nom de franges d’ordre chromatique �gal (Fringes of Equal Chromatic Order, FECO).4-6 La Figure 2.3 illustre des franges FECO typiques (en noir et blanc, les franges originales �tant en couleur) produites dans l’air par deux surfaces de mica de m�me

58

�paisseur en interaction. La forme et la position des franges, mesur�es en longueur d’onde, sont directement reli�es � la topographie r�elle et � la distance de s�paration entre les deux surfaces.

Figure 2.3 : Principe de la mesure de distance de s�paration entre deux surfaces en utilisant les FECO. La forme des franges FECO observ�es au spectrom�tre diff�re lorsque les surfaces de mica sont en contact adh�sif (extr�mit� des franges aplatie) ou s�par�es d’une distance D (pas de r�gion aplatie). La longueur d’onde des franges d’interf�rence ( λn ) permet de d�terminer la distance de s�paration D.

La forme des franges repr�sente la g�om�trie des surfaces. La s�paration absolue D entre deux surfaces de mica de m�me �paisseur est obtenue � l’aide de l’�quation suivante :7
 1 − λn0 / λnD  2 μ sin  π 1 − λn0 / λn0−1   2πμ D    tan  D  = 0 D  λn  1 + μ 2 cos  1 − λn / λn π  � μ 2 − 1 1 − λ 0 / λ D  n n −1  

(

)

(

)

(2.5)

59

o� le signe � + � fait r�f�rence aux franges impaires (d’ordre n) et le signe � - � aux franges paires (d’ordre n-1). Avec � = �mica / � , o� �mica est l’indice de r�fraction du mica � la longueur d’onde λnD et � est l’indice de r�fraction du milieu entre les surfaces de mica � λnD . λn0 et λn0−1 correspondent aux longueurs d’onde des franges

FECO paires et impaires respectivement lorsque les surfaces sont en contact et λnD et

λnD −1 correspondant aux longueurs d’ondes des franges FECO paires et impaires lorsque
les surfaces sont s�par�es d’une distance D.

2.3 La microscopie � force atomique (AFM)
2.3.1 Principe de la mesure Le principe de mesure de cette technique est identique � celui du SFA d�crit pr�c�demment et est pr�sent� � la Figure 2.1. Toutefois quelques diff�rences sont � noter. Comme nous l’avons vu, l’�quation 2.2 permet de reconstruire la loi de force F(D) sur l’intervalle de s�paration d�sir� si est seulement si on peut mesurer de mani�re ind�pendante la s�paration D, la d�flection du levier ΔDc et la raideur du levier Kc. L’AFM ne permet malheureusement pas de mesurer directement D et il est donc n�cessaire d’utiliser une m�thode alternative. Les quatre distances importantes d�finissant le syst�me (voir Figure 2.1) sont reli�es par D0 = D + Dc + Ds, donc leur variation est reli�e par l’�quation suivante : ΔD = ΔD0 – [ΔDc + ΔDs ] (2.6) Donc, une mesure simultan�e de ΔD0, ΔDc et ΔDs permet de d�terminer la variation de D mais pas sa valeur absolue. Les AFM commerciaux sont g�n�ralement con�us pour mesurer ΔD0 et ΔDc mais ne permettent pas de mesurer D ou la d�formation des substrats dans la zone d’interaction ΔDs. La constante de raideur du levier peut �tre mesur�e suivant plusieurs m�thodes8, 9 mais les param�tres d�pendant de la g�om�trie et la composition locale des surfaces, tels que R, ΔDs, a et Ks ne sont pas mesurables directement et doivent �tre suppos�s ou mod�lis�s.

60

La mesure d’une loi de force par AFM utilise l’approximation ΔDs = 0. Ceci permet de mesurer la variation de la distance de s�paration et de la force lors d’un changement de position du levier. Les �quations 2.2 et 2.6 sont alors simplifi�es : ΔD = ΔD0 – ΔDc et ΔF = KcΔDc 2.3.2 Le microscope � force atomique Il existe un grand nombre de mod�les d’AFM poss�dant chacun des caract�ristiques particuli�res. Certains mod�les sont sp�cialis�s pour les mesures en phase aqueuse, alors que d’autres sont con�us pour les mesures sous ultra vide. Malgr� certaines diff�rences de conception, tous les microscopes utilisent le m�me principe technique pour la mesure de la d�flexion du levier, ΔDc (voir Figure 2.5 ci-dessous).
Lat�ral Diode � cadrans Normal

(2.7) (2.8)

Base Rayon Laser ΔD0 Transducteur piezo �lectrique

D�flexion du levier ΔDc

Levier, Kc

D

Surface
Figure 2.4 : Repr�sentation sch�matique du microscope � force atomique (mod�le Multi Mode Dimension vendu par Digital Instrument) servant � imager la 61

topographie de surface gr�ce � la force d’interaction que d�tecte une pointe se d�pla�ant verticalement ou lat�ralement sur l’�chantillon.10 La pointe est attach�e au bout d’un levier de raideur Kc dont la d�flection ΔDc permet d’obtenir la force normale ou lat�rale exerc�e sur la pointe. Ces d�flexions sont d�tect�es par une diode � cadrans en suivant le mouvement d’un rayon laser r�fl�chi � l’extr�mit� du levier. Le d�placement relatif ΔD0 de la pointe par rapport � la surface est accompli par un transducteur piezo �lectrique dans les 3 directions x, y et z. L’imagerie par AFM peut se faire en mode contact ou en mode contact intermittent. Dans la mode contact, la pointe reste en contact permanent avec la surface pendant le balayage. Ce mode permet d’obtenir des images de haute r�solution sur des objets peu rugueux. Dans le mode contact intermittent, la pointe oscille verticalement � une distance de quelques angstr�ms de la surface. Ce mode est recommand� pour les surfaces rev�tant un mat�riau souple et fragile car il endommage peu les surfaces et limite les d�formations lat�rales. En mode contact intermittent, trois types d’image peuvent �tre collect�s simultan�ment durant le balayage : les images topographiques (ou images isoforce), les images de d�flexion (correspondant � la d�riv�e des mouvements de r�ajustement de la position relative entre la pointe et l’�chantillon) faisant ressortir les d�tails de la surface et enfin les images de d�phasage entre le mouvement oscillant impos� et le mouvement r�el qui met en avant des zones de propri�t�s de surface diff�rentes (adh�sion, �lasticit�). La r�solution lat�rale de cette technique est de l’ordre de l’Angstr�m dans la plupart des mod�les commerciaux et d�pend de beaucoup de param�tres exp�rimentaux comme la g�om�trie de la sonde balayante, du syst�me m�canique de balayage ou du contr�leur utilis�. 2.3.3 La nano-indentation La mesure des propri�t�s m�caniques d’une surface ou d’un objet d�pos� sur une surface peut se faire par AFM en utilisant le mode profil de force (technique de nano-indentation). Dans ce mode, la pointe de l’AFM suit une trajectoire verticale sur une distance pr�d�termin�e par l’utilisateur tout en conservant les m�mes coordonn�es

62

lat�rales. De cette mani�re, la force d’interaction pointe-substrat peut �tre obtenue avec une r�solution de quelques pN.11 Le profil de force obtenu peut ensuite �tre utilis� pour extraire le module de Young du substrat. Pour un mat�riau �lastique, lin�aire, isotrope et semi-infini indent� par une sonde non-adh�sive, rigide et de g�om�trie connue, le profile de force peut �tre d�crit par les relations suivantes :

ΔF=

2Etan ( θ ) π 1-ν
1

(

2

)

ΔDc 2 pour un indenteur conique

3 2ER 2 ΔF= ΔDc 2 pour un indenteur sph�rique 2 3 1-ν

(

)

o� E est le module de Young du mat�riau indent�, ν le ratio de Poisson, θ le demi angle d’ouverture du c�ne d’indentation et R le rayon de la sonde.
Les sondes commerciales ne sont g�n�ralement ni sph�riques ni coniques mais plut�t pyramidales avec un demi-angle d’ouverture de 35�. Pour de petites indentations, seul l’apex de la sonde entre en contact avec l’�chantillon et par cons�quent peut �tre consid�r� comme �tant sph�rique. Pour des indentations plus importantes, l’�chantillon interagit fortement avec une grande partie de la g�om�trie pyramidale de la sonde qui doit �tre approxim�e comme un c�ne. L’erreur commise en approximant une g�om�trie pyramidale par une g�om�trie conique peut �tre partiellement corrig�e en utilisant une sonde ayant un demi angle d’ouverture plus grand (38� au lieu de 35�)12 ou bien en utilisant un coefficient num�rique diff�rent dans l’�quation de l’indenteur conique (3/4 au lieu de 2/π) 13. Les deux g�om�trie conique et pyramidale peuvent �tre combin�es en une seule fonction continue d�crivant le profile de force14. La validit� des approximations utilis�es doit �tre test�e en caract�risant la sonde mais aussi en s’assurant que les mod�les Hertzien pr�sent�s s’ajustent bien aux donn�es exp�rimentales. Une alternative au probl�me du contr�le et de la caract�risation de la g�om�trie de l’indenteur est l’utilisation de sondes faites maison con�ues pour avoir une g�om�trie tr�s bien d�finie. Par exemple, il est possible de coller une particule microm�trique sur la pointe d’une sonde afin d’obtenir un indenteur sph�rique. La garantie d’un contact sph�rique permet d’am�liorer la pr�cision et de r�duire l’�tendue du champ de d�formations autour de la sonde. Pour des �chantillons mous (ayant un module de Young entre 1 et 100 kPa), les d�formations induites par un une sonde pointue peuvent facilement exc�der le r�gime de

63

d�formation lin�aire consid�r� par les mod�les hertzien.15 Bien que l’utilisation de microsph�res comme sondes permette de r�duire �norm�ment ce probl�me, elle g�n�re aussi une perte importante de la r�solution lat�rale. Le mod�le de Hertz pour un indenteur sph�rique donne un rayon de contact de l’ordre de (RΔDc)1/2 soit approximativement 390 nm pour une sph�re de 5 μm et une indentation de 30 nm typique pour les hydrogel. En plus des probl�mes mentionn�s pr�c�demment, il est possible que le champ de d�formations induit par l’indenteur se propage le long the l’axe d’indentation. Pour des �chantillons relativement fins, ceci peut introduire de fortes d�viations au mod�le de Hertz qui consid�re l’�chantillon comme semi infini. La contribution de cet effet g�n�re une erreur qui varie comme (RΔDc)1/2/h, h �tant l’�paisseur de l’�chantillon.15

L’AFM et le SFA permettent tous deux de mesurer des profils de force dans un nombre tr�s vari� de milieux. Les deux techniques pr�sentent malgr� tout des diff�rences majeures. La mesure par AFM ne permet pas d’obtenir la s�paration absolue entre surfaces ce qui oblige � faire une approximation souvent hasardeuse pour son obtention. De plus, les sondes utilis�es � l’AFM ont un rayon de courbure allant de quelques nanom�tres (sonde pyramidale) � quelques microns (sonde collo�dale). La pression appliqu�e au contact sonde-substrat est donc tr�s �lev�e ce qui a pour cons�quence la d�gradation m�canique rapide du substrat. De plus, les sondes utilis�es en AFM sont connues pour �tre rugueuses au niveau de l’apex (aussi bien pour les sondes collo�dales que pyramidales) ce qui complique bien souvent l’interpr�tation des r�sultats obtenus. Du fait de la petite taille des sondes utilis�es en AFM, cette technique permet de mesurer les propri�t�s m�caniques locales d’un mat�riau et de combiner cette information avec des donn�es topographiques ou tribologiques. La r�solution lat�rale de la technique �tant excellente, il est possible de faire des mesures m�caniques � l’�chelle atomique de mani�re quasi routini�re. Le SFA permet de mesurer la distance de s�paration entre surfaces avec une pr�cision de l’ordre de l’Angstrom ce qui en fait un outil id�al pour la mesure des profils de force. Les surfaces utilis�es ayant des dimensions beaucoup plus grandes qu’� l’AFM, la technique permet de mesurer des propri�t�s physiques � l’�chelle atomique sur des syst�mes macroscopiques. La technique permet d’obtenir certaines informations sur la g�om�trie du contact avec une r�solution lat�rale beaucoup moins bonne que celle de

64

l’AFM. Le SFA ne permet pas d’obtenir les propri�t�s physiques locales d’un mat�riau mais plut�t une moyenne de celles-ci sur l’aire de contact.

2.4 Les microscopies � fluorescence
2.4.1 Origines de la fluorescence

L’absorption d’une onde �lectromagn�tique par une mol�cule est soumis aux r�gles de la m�canique quantique. Pour qu’un photon d’�nergie hν soit absorb�, il faut que cette �nergie corresponde au minimum � la diff�rence d’�nergie entre le niveau �lectronique de plus basse �nergie et celui des niveaux excit�s de plus haute �nergie. De plus, pour que cette transition soit possible, il est n�cessaire que la multiplicit� des �tats soit compatible � savoir une transition de type singulet – singulet (S0 → Sn). Apr�s excitation, la mol�cule se d�sactive suivant des processus radiatifs et non radiatifs. Les processus non radiatifs correspondent aux m�canismes de relaxation non associ�s � une �mission de photon tel la relaxation vibrationnelle, la conversion inter-syst�me singulet – triplet, le transfert d’�lectron, la s�paration de charges, et la r�action chimique. Les processus radiatifs correspondent au retour de l’�lectron excit� S1 � son niveau fondamental S0 par �mission d’un photon d’�nergie �gale � la diff�rence d’�nergie entre le niveau excit� et le niveau fondamental. Les transitions �lectroniques entre niveaux de multiplicit�s diff�rentes sont interdites par les r�gles de la m�canique quantique, ce qui signifie qu’exp�rimentalement elles sont tr�s peu accessibles. Les ph�nom�nes de fluorescence sont donc des m�canismes rapides (quelques picosecondes � quelques nanosecondes). Les processus de fluorescence � partir de niveaux �lectroniques autres que S1 (premier niveau �lectronique excit�) sont extr�mement rares et donc de faible intensit�. Si la mol�cule est excit�e � un niveau �lectronique sup�rieur, elle relaxe g�n�ralement par un mode vibrationnel pour atteindre le niveau S1.
2.4.2 La microscopie confocale et � fluorescence

65

Le couplage des m�thodes d’analyse de la fluorescence aux techniques de microscopie est couramment utilis� en biologie.16 Les techniques de fluorescence permettent aussi bien l’observation de particules ou structures m�taboliques par marquage direct16 que la mise en �vidence de processus biologiques en utilisant des proc�d�s de r�v�lation ou d’extinction de fluorescence.17,
18

On compte � l’heure

actuelle de nombreuses techniques de microscopie � fluorescence. Nous nous limiterons � d�crire celles qui ont �t� utilis�es dans le cadre de ce travail, c'est-�-dire la microscopie confocale et la microscopie � �pifluorescence. En microscopie � fluorescence, la source lumineuse est plac�e sous l’�chantillon � analyser ce qui limite son champ d’utilisation aux �chantillons tr�s minces. Pour pouvoir observer des �chantillons plus �pais, le faisceau d’excitation percute l’�chantillon par le dessus en passant par l’objectif (voir Figure 2.6). La s�paration du faisceau excitant incident du faisceau �mis se fait � l’aide d’un miroir dichro�que. La microscopie confocale utilise les m�mes principes que la microscopie � �pifluorescence. La source lumineuse d’excitation est un faisceau laser puls� focalis� sur un premier filtre spatial (voir Figure 2.6). Ce filtre a pour but de d�finir avec pr�cision la position du point de la source d’excitation. L’�mission de fluorescence de l’�chantillon collect�e par l’objectif est focalis�e sur le trou confocale plac� devant le d�tecteur. Le d�tecteur s�lectionne les photons provenant uniquement du plan focal de l’objectif. Les photons �mis avant ou apr�s le plan focal sont �limin�s par le filtre spatial. L’�mission de fluorescence est alors spatialement localis�e au sein de l’�chantillon. Un syst�me de d�placement fin permet de mesurer l’�mission de fluorescence sur diff�rents plans XY et � diff�rentes profondeurs Z de l’�chantillon. La r�solution lat�rale de ces techniques est de l’ordre de la longueur d’onde de la lumi�re utilis�e pour illuminer l’�chantillon, autrement dit de l’ordre de la centaine de nanom�tre ce qui limite sont usage � des syst�mes de tailles microm�triques comme des cellules.

66

D�tecteur D�tecteur

Trou miroir miroir

objectif source objectif Y X Z �chantillon source (a) Microscope (b) Microscope a �pifluorescence (c) Microscope confocal �chantillon Filtre

source

Figure 2.5 : Sch�ma de principe des trois types de microscopies : (a) microscopie

optique ; (b) microscopie � �pifluorescence et (c) microscopie confocale

2.5 R�f�rences
1. Israelachvili, J. N.; McGuiggan, P. M., Adhesion and Short-Range Forces

between Surfaces .1. New Apparatus for Surface Force Measurements. Journal of

Materials Research 1990, 5, (10), 2223-2231.
2. 3. Israelachvili, J. N., Intermolecular and Surface Forces. 2nd edn. ed.; Academic Israelachvili, J. N.; Adams, G. E., Measurement of Forces between 2 Mica PRess: London & New York, 1990. Surfaces in Aqueous-Electrolyte Solutions in Range 0-100 Nm. Journal of the

Chemical Society-Faraday Transactions I 1978, 74, 975-&.
4. 5. Israelachvili, J. N., Thin-Film Studies Using Multiple-Beam Interferometry. Heuberger, M.; Luengo, G.; Israelachvili, J., Topographic information from

Journal of Colloid and Interface Science 1973, 44, (2), 259-272.
multiple beam interferometry in the surface forces apparatus. Langmuir 1997, 13, (14), 3839-3848. 6. Tolansky, S., Multiple Beam Interferometry of Surfaces and Films. Oxford University Press: 1948.

67

7. 8. 9. 3969. 10. 11.

Israelachvili, J. N., J. Colloid Interface Sci. 1973, 44, 259. Hutter, J. L.; Bechhoefer, J., Calibration of Atomic-Force Microscope Tips (Vol Sader, J. E.; Chon, J. W. M.; Mulvaney, P., Calibration of rectangular atomic

64, Pg 1868, 1993). Review of Scientific Instruments 1993, 64, (11), 3342-3342. force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments 1999, 70, (10), 3967Leckband, D.; Israelachvili, J., Intermolecular forces in biology. Quarterly Heinz, W. F.; Hoh, J. H., Spatially resolved force spectroscopy of biological

Reviews of Biophysics 2001, 34, (2), 105-267.
surfaces using the atomic force microscope. Trends in Biotechnology 1999, 17, (4), 143-150. 12. 13. 14. 15. Radmacher, M., Measuring the elastic properties of living cells by the atomic Bilodeau, G. G., Regular Pyramid Punch Problem. Journal of Applied Costa, K. D.; Yin, F. C. P., Estimating mechanical properties by indentation Dimitriadis, E. K.; Horkay, F.; Maresca, J.; Kachar, B.; Chadwick, R. S., force microscope. Atomic Force Microscopy in Cell Biology 2002, 68, 67-90.

Mechanics-Transactions of the Asme 1992, 59, (3), 519-523.
with the atomic force microscope. Biophysical Journal 1999, 76, (1), A264-A264. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal 2002, 82, (5), 2798-2810. 16. 17. Amos, W. B.; White, J. G., How the Confocal Laser Scanning Microscope Vaiana, A. C.; Neuweiler, H.; Schulz, A.; Wolfrum, J.; Sauer, M.; Smith, J. C., entered Biological Research. Biology of the Cell 2003, 95, (6), 335-342. Fluorescence quenching of dyes by tryptophan: Interactions at atomic detail from combination of experiment and computer simulation. Journal of the American

Chemical Society 2003, 125, (47), 14564-14572.
18. Bastiaens, P. I. H.; Pepperkok, R., Observing proteins in their natural habitat: the living cell. Trends in Biochemical Sciences 2000, 25, (12), 631-637.

68

CHAPITRE 3 Selectins Ligand Decorated Drug Carriers for Activated Endothelial Cell Targeting

ABSTRACT New active particulate polymeric vectors based on branched polyester copolymers of hydroxy-acid and allyl glycidyl ether were developed to target drugs to the inflammatory endothelial cell surface. The hydroxyl and carboxyl derivatives of these polymers allow grafting of ligand molecules on the polyester backbones at different densities. A known potent non-selective selectin ligand was selected and synthesized using a new scheme. This synthesis allowed the grafting of the ligand to the polyester polymers, preserving its binding activity as assessed by docking simulations. Selectin expression on human umbilical cord vascular endothelial cells (HUVEC) was induced with the pro-inflammatory bacterial lipopolysaccharide (LPS) or with the non-selective inhibitor of nitric oxide synthase L-NAME. Strong adhesion of the ligand decorated nanoparticles was evidenced in vitro on activated HUVEC. Binding of nanoparticles bearing ligand molecules could be efficiently inhibited by prior incubation of cells with free ligand demonstrating that adhesion of the nanoparticles is mediated by specific interaction between the ligand and selectin receptors. These nanoparticles could be used for specific drug delivery to the activated vascular endothelium suggesting their application in the treatment of diseases with an inflammatory component such as rheumatoid arthritis and cancer.

69

3.1 Introduction
Inflammation is a naturally occurring defense mechanism upon exposure to specific antigens, chemicals, infections, and physical stress. It is characterized by different events taking place at or near the injured area, including vascular endothelium cell (VEC) activation and leukocyte accumulation. VEC, upon activation by proinflammatory cytokines, increases the expression of cell adhesion molecules (CAMs) in a highly regulated and sequential process. This sequence involves expression of Pselectin followed by E-selectin, which promote rolling and tethering of leukocytes along the vessel wall 1. Exaggerated and/or prolonged inflammatory response is associated with alarge number of acute and chronic disorders, including organ ischemia/reperfusion injury, allergic asthma, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, and atherosclerosis. The selectin family has three members, namely, L-, E-, and P-Selectin. Their expression is restricted to circulating leukocytes (L-selectin) and VEC (P- and Eselectins). Upon inflammatory stimulation, P-selectin (CD62P) appears rapidly at the cell surface, owing to its intracellular storage in Weibel-Palade bodies. On the other hand, maximum levels of E-selectin (CD62E) are reached in 4-6 h after activation, due to de novo synthesis 2. Since E-selectin is expressed in both acute and chronic inflammation, it has been considered as a good candidate for drug targeting. In addition, the cytokines IL-1β and TNFα, as well as bacterial lipopolysaccharide (LPS), have been shown to stimulate the expression of E-selectin 3. Moreover, E selectin is reported to exhibit a highly localized expression in neovasculature 4 and prostate cancer
5

. The natural ligands of E- and P-selectin are either fucosylated glycoproteins (ESL-1,

for E-selectin ligand) or sialomucin glycoproteins (PSGL-1 for P-selectin glycoprotein1) presenting sialylated carbohydrate moieties (sialyl-Lewis x, sLex) epitopes. These selectin ligands are known to be present on circulating leukocytes plasmatic membrane
6, 7

. Synthetic analogues of the natural ligands have been investigated for their ability to
6, 8, 9

block inflammation

. Some of these analogues have been reported to have higher

affinity to the target compared to the natural ligand, rendering them very attractive molecules for active drug targeting developments.

70

Among promising new therapeutic approaches, targeted drug carriers have received increasing interest during the past few decades 10. These carriers aim to release the drug close to the pathologic site, protecting the active substance from fast degradation and elimination leading to dose reduction and avoiding side effects. Several approaches such as drug immunoconjugation, bioconjugation, liposomes, dendrimers, micelles, or coated nanoparticles (NPs) have been proposed to achieve active or passive targeting of drug. However, compared to other delivery systems, polymeric NP drug carriers offer the possibility of encapsulating several types of molecules and protecting them from enzymatic degradation. The polymers forming the NP carriers are generally highly stable in physiological media and allow controlled release by matrix degradation. A general approach to confer targeting capabilities to NPs is to functionalize their surface with a specific ligand. This approach is strongly limited by the stability of the link between the ligand and the NP surface. If this link is not stable enough in physiological media, release of the ligand (by hydrolysis, for example) from the NP surface could be rapid. To circumvent this severe drawback and to improve the binding properties of the NPs, new coupling strategies must be investigated. Specific drug delivery to activated VECs to modulate the inflammation response have been shown to be a valid therapeutic strategy 11. Drug immunoconjugation 12, 13 and immunoliposomes directed against E-selectin 14-16, as well as liposomes incorporating sLex as ligands 17-19, are among the most described methods. They all present the strong disadvantage of using natural ligands (as sLex) which are in competition with the free homologue in the bloodstream. In this study, a ligand of E- and P-selectin was synthesized and conjugated to a polyL D

, -lactic acid polymer (PLA). The ligand is a nonselective selectin antagonist, which

may be advantageous in pathological settings involving both P- and E-selectin activities. The conjugation was done using carboxylic acid functions introduced in the PLA backbone. This functionalized polymer was subsequently mixed with pure PLA to form the NPs. NPs formulated with ligand functionalized PLA (NPL) present higher adhesive capabilities to HUVEC plasmatic membrane compared to non functionalized PLA NPs. Inhibition of binding could be observed for NP-L when cells are incubated with free ligand prior to the NP introduction. This study provides strong evidence that

71

NPs functionalized with the synthetic ligand can specifically bind to endothelial cells activated by proinflammatory molecules.

3.2 Experimental procedures
3.2.1 Materials. Chemicals were purchased from Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada). Solvents were from Laboratoire MAT (Que�bec, PQ, Canada). All media and reagents for cell culture were purchased from Gibco (Invitrogen, Burlington, ON, Canada). Human vascular endothelial cells (CRL 1730) were from ATCC; Raw 264.7 murine macrophage cell line was a gift from Pr. J. C. Leroux. 3.2.2 Ligand docking simulations. All simulations were performed with E-selectin receptor using GOLD (Genetic Optimisation for Ligand Docking) docking program20 in order to identify the most probable conformation of the free and grafted ligand interacting with its receptor. The structure of the chosen ligand can be seen in Scheme 1. The protein data file was obtained from the structure published by Somers et al.21 The protein was prepared as described by Jones et al.20, 22 The ligand and grafted ligand (Scheme 1 and compound (9)) were built using Material Studio software (Accelrys, San Diego, USA) and their structure was minimized using the Discover module assigning CFF force field to each atom. The grafted ligand consisted of a ligand molecule linked to a PLA chain (of 4 monomers) via a glycidyl linker. For the docking simulations, the binding pocket of Eselectin was defined using the conformation of the natural ligand sialyl Lewis acid X (sLex) given by Somers et al. The two equatorial hydroxyl groups of the mannose ring of the studied ligand were constrained to bind the calcium ion present in the binding pocket. In that way, the mannose ring of the ligand overlaid onto the L-fucose ring of the sLex and the glutamate side chain was free to bind to the protein amino acids. More than 30 genetic algorithm runs were performed in order to identify best fitting

72

structures. The final optimized conformations were picked using GOLD scoring function.
HO OH O HO HO H N O O O OH OH

Scheme 3.1 Chemical structure of the synthetic ligand of E and P-selectin 3.2.3 Ligand synthesis A general scheme of the ligand synthesis is represented in Scheme 2.
HO OH O CH 3 O (3) OH OH

O HO HO (1) NH2 O

BnO OBn O (4) OBn OAc

O BnO BnO (2) NH 2 pTsOH O +

BnO OBn O HO O (5) OBn OH

BnO OBn O BnO BnO H N O O O OBn OH

(6)

Scheme 3.2 General synthesis of the selectin ligand

73

Synthesis of fragment 2 25.5 g of p-toluene sulfonic acid (pTsOH) were added to a solution of 10 g glutamic acid 1 in 100 g of benzylic alcohol under N2 atm. The mixture was heated at 80 �C for 24 h under stirring and subsequently poured onto 1 L aqueous solution of 1 M NaOH and extracted three times with diethyl ether (Et2O). The organic phases were pooled and dried on Na2SO4. A solution of 10 g (pTsOH) sulfonic acid (pTsOH) in 100 mL Et2O was added to the organic phase, which was kept at 4 �C for 24 h. The crystals obtained were filtered and washed with ether to yield 12.3 g of product 2 (36% yield) NMR 1H (400 MHz, DMSO-D6) δ 2.00-2.17 (m, 2 H, -CH2-CH2-CH-), 2.28 (s, 3 H, CH3- (pTsO-)), 2.43-2.66 (m, 2 H, -CH2-CO2Bn), 4.17 (t, 6.60 Hz, 1 H, -CH(NH3+)CO2-), 5.05-5.12 (m, 2 H, -CH2-Ph), 5.17-5.26 (m, 2 H, -CH2-Ph), 7.12 (d, 8.0 Hz, 2 H, aromatic pTsO-), 7.31-7.43 (m, 10 H, aromatic -Bn), 7.51 (d, 8.0 Hz, 2 H, aromatic pTsO-), 8.28-8.64 (m, 3 H, -NH3+). SM (FAB) m/e 328.5 (M+H-pTsOH, 100 %), 192.3 (10 %), 154.2 (32 %). Synthesis of fragment 4 3.8 g of tetrabutyl ammonium iodide (TBAI) and 54 mL of bromobenzyl (BnBr) were added to a 10% (w/w) solution of D-methylmannoside 3 in dimethyl formamide (DMF) under N2 atmosphere. The mixture was cooled down to 0 �C and 18.2 g of NaH was slowly added to avoid a temperature rise. The mixture was stirred for 16 h and cooled down to 0 �C. 100 mL of isopropanol was slowly added, followed by 20 g of salicylic acid. The solution was evaporated and redissolved in 500 mL of ethyl acetate (EtAc). The organic phase was washed three times successively with 100 mL NaOH 10%, 100 mL 1 N HCl, and 100 mL NaCl saturated salt solutions. The organic phase was dried on Na2SO4, filtered, and evaporated. The residual product was purified by flash chromatography on silica with an eluent mix 10:90 to 20:80 Et2O and hexane (HEX) to yield 27.3 g (43%) of intermediate product. NMR 1H (400 MHz, CDCl3) δ 3.35 (s, 3 H, -OCH3), 3.74-3.84 (m, 4 H), 3.90-3.93 (m, 1 H), 3.97-4.04 (m, 1 H), 4,51-4.82 (m, 8 H), 4.91 (d, 11.0 Hz, 1 H), 7.17-7.42 (m, 20 H, aromatic). NMR 13C (400 MHz, CDCl3) δ 54.7, 69.2, 71.6, 72.0, 72.5, 73.3, 74.4, 74

74.8, 75.0, 80.2, 98.9, 127.4-128.4 (m, 20 C), 138.2-138.4 (m, 4 C). SM (FAB) m/e 553.4 (M-H, 7 %), 271.4 (10 %), 181.3 (100 %). SMHR Calculated for C35H37O6 (MH) 553.2590, found 553.2600 (-1.8 ppm). Allyl-trimethylsilane (14.3 mL) and trimethylsilyle triflate (4.1 mL) were added to a solution of 25 g of intermediate product in acetonitrile (ACN) at 0 �C under N2 atmosphere. The mixture was maintained at 4 �C for 16 h and then 65 mL of anhydrous acetic acid were added. Under stirring at room temperature, 600 mL of dichloromethane (DCM) and 60 mL of aqueous solution of NaHCO3 were added to the mixture. The pH was adjusted to 12 with 10%w/v NaOH. After phase separation, the aqueous phase was extracted with 300 mL of DCM. The obtained organic phases were pooled, dried on Na2SO4, and filtered. The solvents were eliminated by distillation under vacuum. The residual product was purified by flash chromatography on silica, using a mix of Et2O and HEX in proportion ranging from 25:75 to 100:0 to yield 18.5 g (79 %) of product 4. NMR 1H (400 MHz, CDCl3)
δ

2.05 (s, 3 H, Ac-), 2.24-2.40 (m, 2 H), 3.61-3.64 (m,

1 H), 3.75-3.83 (m, 3 H), 4.05-4.10 (m, 1 H), 4.23-4.27 (m, 1 H), 4.37-4.42 (m, 1 H), 4.53-4.63 (m, 5 H), 4.74-4.77 (m, 1 H), 4.99-5.04 (m, 2 H), 5.67-5.77 (m, 1 H), 7.277.37 (m, 15 H, aromatic). Synthesis of fragment 5 90 mL water and 4.5 mL of an aqueous solution of 50 % (w/w) of 4Methylmorpholin N-oxyde (NMO) were added to a solution of 9.00 g of compound 4 in 90 mL distilled acetone, followed by an addition of 2.25 mL of a 2.5 % (w/w) solution of osmium tetraoxyde in t-butanol. The solution was stirred for 3 h, then 2.25 mL of an aqueous solution of 10 % (w/w) Na2S2O3, 9 g of Florisil� and 180 mL of water were added. The pH was adjusted to 1 with HCl 1 M. The aqueous phase was extracted three times with 500 mL of EtAc. The organic phases were pooled, dried on Na2SO4 and filtered. The solvent was eliminated by distillation under vacuum. The diol intermediate product was used in the next step without purification. 4.5 g of sodium periodate and 90 mL of water were added to a solution of 17.4 mM of the intermediate diol in 90 mL THF. The solution was stirred for 1 h and then 450 mL of water were added. The

75

aqueous phase was extracted three times with 450 mL of EtAc. The organic phases were pooled, dried on Na2SO4, filtered and the solvent was eliminated by distillation under vacuum. The residual aldehyde product was used in the next step without further purification. 20.9 mM of CrO3 from the Jones reagent (CrO3 : H2SO4 : H2O, 1 : 1 : 3) were added to a solution of 17.4 mM of aldehyde product in 90 mL of distilled acetone at 0 �C. After 15 min, reagent in excess was neutralized by the addition of 10 mL of isopropanol. The solution was poured on 900 mL of HCl 1 M, and extracted three times with 400 mL of EtAc. The organic phases were pooled and the remnant solvent was eliminated by distillation under vacuum. The aldehyde product was used in the next step without further purification. A solution of 4.0 g Potassium Hydroxyde was prepared with 20 mL water and 20 mL of methanol (MeOH). This solution was added to a solution of 17.4 mM of intermediate aldehyde compound in 100 mL MeOH. 100 mL of potassium hydroxyde 10 % (w/v) was further added and the mixture and poured in 1 L HCl 1 N then the aqueous phase was extracted three times with 500 mL EtAc. The organic phases were pooled, dried on Na2SO4, filtered and the solvent was eliminated by distillation under vacuum. The residual product was purified by flash chromatography on silica using Et2O as the eluent to obtain 7.56 g of acid alcohol 5. The yield of the synthesis was 88 %. NMR 1H (400 MHz, CDCl3) δ 2.54 (dd, 9.9 and 16.7 Hz, 1 H), 2.82 (dd, 3.3 and 16.8 Hz, 1 H), 3,45 (dd, 3,7 and 12.1 Hz, 1 H), 3.55 (dd, 3.6 and 5.0 Hz, 1 H), 3.62 (dd, 2.8 and 7.6 Hz, 1 H), 3.81 (dd, 3.0 and 5.0 Hz, 1 H), 3.84-3.92 (m, 1 H), 4.21 (dd, 9.1 and 12.2 Hz, 1 H), 4.39-4.59 (m, 7 H), 7.22-7.38 (m, 15 H), -OH and –COOH absent. SM (FAB) m/e 515.2 (M + Na, 4 %), 271.1 (8 %), 181.1 (100 %), 132.9 (51 %). SMHR Calculated for C29H32O7Na (M + Na) 515.2046, found 515.2032 (+ 2.7 ppm). Coupling 2 and 5 : protected ligand 6 9.5 g of amine tosylate 2 were solubilised in 200 mL of EtAc and mixed three time with the same volume of sodium hydroxyde 1 N. The amine compound corresponding to 2 was obtained after drying the organic phase on Na2SO4, filtration and elimination of the solvent by evaporation under vacuum. A 10 % (w/w) solution of the acid alcohol 5 in DCM was added with a canula to a solution containing 2.4 g of ethyl-3-(3-

76

dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC). 1,7 g of 1-hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) and compound 2 were mixed in 31 mL DCM under N2 atmosphere. The solution was stirred for 16 h. Solvents were eliminated by distillation under vacuum. The residual product was purified by flash chromatography on silica using 1: 1 EtAc/HEX to get 3.17 g of the protected ligand 6 (yield of 63 %). NMR 1H (400 MHz, CDCl3) δ 1.92-2.02 (m, 1 H), 2.14-2.23 (m, 1 H), 2,31-2.45 (m, 3 H), 2.69 (dd, 2.0 and 15.4 Hz, 1 H), 3.40 (dd, 3.0 and 12.3 Hz, 1 H), 3.50 (dd, 3.0 and 4.8 Hz, 1 H), 3.57 (dd, 2.6 and 8.2 Hz, 1 H), 3.78 (dd. 3,1 and 4.4 Hz, 1 H), 3.96-4.01 (m, 1 H), 4.26 (dd, 9.9 and 12.4 Hz, 1 H), 4.33-4.40 (m, 1 H), 4.43-4.61 (m, 6 H), 4.674.74 (m, 1 H), 5.05 (d, 12.3 Hz, 1 H), 5.09 (d, 12.4 Hz, 1 H), 5.14 (s. 2 H), 7.15-7.39 (m, 25 H), -OH and –CONH- absent. NMR
13

C (400 MHz, CDCl3)

δ

27.07, 30.28,

37.27, 51.49. 59.92, 66.51, 67.50, 71.52, 72.47, 72.83, 74.69, 75.72, 76.89, 127.76128.60 (25 �C), 134.98, 135.66, 137.63, 137.68, 137.78, 171.20, 172.51, 172.70. SM (FAB) m/e 802.2 (M+H, 68 %), 694.3 (10 %), 418.2 (8 %), 328.1 (12 %), 271.1 (6 %), 181.1 (100 %), 136.0 (14 %). SMHR Calculated for C48H52NO10 (M+H) 802.3591, found 802.3554 (+4.6 ppm). 3.2.4 Polymer synthesis and subsequent ligand conjugation and deprotection Synthesis of PLA polymer bearing pendant carboxyl groups for ligand grafting has been described elsewhere.23 A solution of PLA 1 mg/mL with 1% (mol/mol) (relative to lactic monomer) acyl chloride pendant groups in chloroform was prepared (polymer 7) and to this were added successively 1.5 equiv of 6 in chloroform at a concentration of 0.25 mM and a 10% (w/v) solution of dimethylamino propane (DMAP) in pyridine. The mixture was stirred for 3 h after which a 1 N HCl solution was added to neutralize the pyridine. Chloroform was evaporated and the aqueous phase was filtered to yield the protected ligand-PLA. Activated palladium (Pd-C 5%) was added to a solution of 0.8 mg/mL of protected ligand-polymer in glacial acetic acid at a ratio of 1 mg/mg. This mixture was placed under hydrogen (atmospheric pressure) for 16 h. Pd-C was eliminated by filtration on Celite (MeOH as eluent). Solvent was eliminated by evaporation, and the product dissolved in chloroform. Chloroform was eliminated by

77

evaporation in the presence of an equivalent volume of water to yield the precipitated polymer in aqueous phase. This step was repeated twice to obtain PLA with 5 mol % of grafted selectin synthetic ligand (compound 9 or PLA-SEL5%) with a 70% yield for the two-step procedure after drying. PLA polymer bearing hydroxyl groups was synthesized as described in Nadeau et al.
23

. Rhodamine B was grafted to the PLA backbone using standard EDC/NHS coupling

reaction. The obtained polymer (PLA-Rhod5%) was precipitated in water and dissolved in DCM after complete water removal. This operation was repeated three times for complete elimination of remnant chemicals. 3.2.5 NPs preparation NPs were prepared by the solvent evaporation method. Briefly, 500 mg of a 1:1 mixture of PLA-Rhod5% and PLA (or PLA-Sel5%) were dissolved in 15 mL of DCM. The polymer solution was then gently injected into 100 mL of aqueous 15% (w/v) of sucrose solution containing a surfactant mixture (2.5% Tween 20, 0.5% PEG Laurate), while emulsification was being achieved by means of high-pressure homogenization (Emulsiflex C30, Avestin, Ottawa, ON, Canada) at 10 000 psi for 3 min in order to obtain the NP suspension. After collection of the NPs, the suspension was stirred for 5 h under reduced pressure to allow solvent evaporation and NP solidification. NP suspension was then lyophilized (Freeze-Dry System, Lyph.Lock 4.5, Labconco) and stored at 4 �C until further use. 3.2.6 NPs characterization Particle size distribution. NPs size distribution was measured by photon correlation spectroscopy (PCS) (N4 Plus, Coulter Electronics, Miami, FL, USA) at 90 ˚ scattering angle for 180 seconds and at 25 ˚C. The mean particle diameter was calculated using differential size distribution processor (SDP) intensity analysis program.

78

Zeta potential measurements. NPs were suspended in 0.25 % (w/v) saline solution filtered through 0.22 μm filter and zeta potential was measured at 25 �C on Malvern ZetaSizer Nanoseries ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) in triplicate. Time-of-Flight secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS). NPs samples were analyzed using a TOF-SIMS IV (ION-TOF GmbH, Munster, Germany). The mass spectra were produced by irradiating the NPs with a 15 keV monoisotopic
69

Ga+

primary ion source with a target current of 1.02 pA in order to stay in static regime (ionic dose lower than 1013 ions/cm2). Mass resolution was above 8200 �ma for 29Si+. The scanned surface area was 40 �m x 40 �m. Both positive and negative secondary ions were collected over a mass range of 5-800 and analyzed. Cytotoxicity assay of NPs. Cytotoxicity assay was performed on two cell lines using MTT cell proliferation assays. RAW 264.7 murine macrophage cell line was cultured in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (Invitrogen Canada, Burlington, ON, Canada). Human vascular endothelium cells were cultivated in F12 Kaighn’s modification medium, 10 % FBS with Penicillin/Streptomycin supplemented with heparin and endothelial growth supplement from neural bovine tissue (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada). Both cell lines were grown in tissue culture flasks and incubated at 37 ˚C in a 5 % CO2 atmosphere. Raw 264.7 cells were diluted in complete medium at a final concentration of 5 � 105 cells/mL and plated (100 �L/well) on a 96 well-flat bottom microplate (Corning, NY, USA). NPs suspended in 10 �L PBS sterile buffer were added in the wells in triplicate for each concentration. The plates were incubated for 24 h after which cellular proliferation was assessed by MTT assay. Cell medium was removed and cell monolayer washed with PBS. Complete medium was replaced and 10 �L of thiazolyl blue tetrazolium bromide (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) dissolved in PBS (10 mM, pH 7.4) at a concentration of 5 mg/mL and filtered on 0.22 �m sterile filter

79

(Millipore, Bedford NMA USA), was added to each well. After 3 h incubation time at 37 ˚C in 5 % CO2 atmosphere, 50 �L of solubilising solution (Isopropanol, 10 % Triton 100X, 0.1 N HCl) was added to each well to dissolve the dark blue formazan crystals. Absorbance was read at a wavelength of 570 nm on a microplate reader (SAFIRE, Tecan, Austria). Procedures with HUVECs were similar, except for initial seeding densities of 2 x 104 cell/m were plated on 96 well-flat bottom microplate (treated with fibronectin) and extra incubation time of 6 h was used prior to addition of solubilising solution. 3.2.7 In vitro binding assays. Selectin induction by pro-inflammatory drugs HUVEC were plated on sterile round cover slips (Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada) treated with human fibronectin at a seeding density of 5�104 cells/wells and grow for 48 h prior to experiment in 24-wells plate (Costar, Corning). Selectin expression on cell surface was induced by LPS (5 μg/mL) or with L-NAME (3 mM) for 4 h. After repeated rinsing with cold PBS, the activated cells were fixed with a filtered 1 % (w/w) formaldehyde PBS solution for 10 min. After addition of 250 μL of blocking solution (2 % (w/v) BSA in PBS) cells were incubated overnight at 4 oC with mouse anti-E-Selectin (clone BBIG-E4 (5D11), R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) or PSelectin (clone P8G8, Chemicon, Temecula, CA,USA) antibodies. After washing with PBS, secondary goat anti-mouse Alexa546 antibody (Invitrogen) was added for 2 h. Cell nucleus staining was performed using Hoechst 33352. All micrographs were taken using an inverted Olympus IX71 microscope (Olympus Canada Inc., Markham, ON) and an Evolution VF camera (MediaCybernetics, Bethesda, MD) with the same 60X objective lens and exposure time to allow comparison of measurements. All images were processed with ImagePro� software (MediaCybernetics, Bethesda, MD). NPs binding assays HUVECs were activated as described above and cooled to 4 �C prior incubation with cold NPs suspension for 5 min (100 μg/wells) in serum free medium. After repeated

80

rinsing with cold PBS, cells were lysed for 2 h at 2 �C with a 0.2 % (w/w) Triton 100 solution (1 N NaOH) and fluorescence intensity was read with a fluorescence plate reader (Ex., 550 nm; Em., 580 nm). A similar procedure was used for studies using the free ligand as an inhibitor. Activated HUVECs were incubated for 30 min at 37 �C with different concentrations of free ligand and cooled to 4 �C before incubation with NPs (50 μg/mL) in serum free medium. After repeated rinsing with cold PBS, cells were lysed during 2 h and fluorescence was read at 25 �C. 3.2.8 Statistical analysis The data were calculated as means � standard error, where statistical significance was determined by Student’s t-test (p < 0.01).

3.3 Results
3.3.1 Ligand docking Simulations The synthetic ligand (see Scheme 1), an analogue of the sLex epitope, was selected in this study due to its high binding affinity for P- and E-selectin8 compared to sLex
9

Ligand docking simulations were performed on E-selectin in order to confirm that grafted ligands still possess high binding affinity to receptors. The synthetic ligand is a mannose-based mimic of sLex, whose structure incorporates a carboxylate group which replaces the Gal residue. Interaction between sLex and E-selectin has been extensively described and is now well-understood. The binding site of E-selectin is known to be located on the lectin domain of the protein. The calcium ion present in this domain has two main functions: to maintain the structure of the binding site (the calcium ion interacts with 5 residues of the protein, namely, Glu80, Asn82, Asn83, Asn105, and Asp106) and to bind the two hydroxyl groups in the equatorial position of the l-fucose ring of the sLex ligand. This last function has been extensively used to develop ligands derived from mannose and having two hydroxyl functions in the equatorial position and another one in the radial position.

81

Results from docking simulations performed with the synthetic ligand showed that the mannose cycle fits in the binding site and interacts strongly with a large number of amino acids forming the binding pocket. One of the two equatorial hydroxyl functions of the mannose ring was able to bond strongly to the calcium ion of the lectin domain, while the other one interacted with Asp106 and Asn83 side chains. Moreover, one carboxylate of the glutamate moiety of the ligand binds strongly to Arg97 and to Tyr48. These interactions allow the ligand to be positioned in a similar direction to sLex. It is interesting to note that the synthetic ligand interacts with the same amino acid as sLex but with almost no steric constraint, which is certainly the cause of its potent inhibition capacity. Moreover, these docking simulations showed that one hydroxyl group of the mannose ring is not involved in the binding pattern and could be used as a coupling function with a macromolecule. We performed another series of docking simulations using the synthetic ligand grafted to a PLA chain of 5 monomers. The interaction pattern of the grafted ligand was very similar to the original nongrafted ligand. We observed that the fitness index of the best structure was much higher for the grafted ligand than for the nongrafted ligand, indicating that the presence of the polymer chain favored binding of the ligand. The conformations of the free and grafted ligands in the binding pocket are slightly different. One remarkable difference is the position of the mannose ring, which is flipped in the case of the grafted ligand (Figure 1). This conformational change allows the polymer chain to lie aside from the binding pocket. Surprisingly, this conformation does not affect the interaction pattern of the ligand. The hydrogen bond network between the receptor and the grafted ligand was identical to that of the free ligand. The same amino acids from the receptor were involved in the interaction pattern as well as the same hydroxyl groups from the mannose ring and the carboxylate groups from the glutamate moiety of the ligand. The main difference between the two interaction patterns is located in the two hydroxyl groups of the mannose ring, which are inverted in the case of the grafted ligand compared to the free ligand configuration.

82

A

B

Figure 3.1 Conformation of the ligand in the bonded state obtained from docking experiments. (A) and (B) Top view of the binding pocket. Protein is represented by the Connelly surface in blue. PLA is represented in orange. Linker monomer is represented in green.

3.3.2 Ligand and Polymer Synthesis Protected ligand 6 was obtained from the coupling between the amine of the protected amino acid 2 and the acid 5 (Scheme 2). A challenging aspect of this reaction was to realize the coupling in the presence of free hydroxyl functions on 5. The reaction sequence was important in order to prevent oxidation of the primary hydroxyl groups into carboxylic acid. We used acetyl functions to protect the primary alcohol during the reaction. As illustrated in Scheme 3, the coupling reaction yielded the amide ligand 6 ready to be grafted to PLA. The grafting of the synthetic ligand to PLA was mediated by an ester linkage on pendant groups of a new family of polyester polymers developed in our laboratory.23 For this purpose, the ligand must present only one reactive hydroxyl group, which does not belong to the active part of the ligand. The use of a benzyl group to protect the other hydroxyl and carboxyl functions was guided by the ease of removal by hydrogenation in one step after polymer grafting. The presence and removal of the benzyl group before and after deprotection of the grafted ligand was confirmed by NMR (data not shown). The ligand grafting reaction takes place between the unprotected hydroxyl group on the ligand 6 and the acyl chloride groups present on the 83

polymer pendant groups 7 in the presence of DMAP and pyridine (Scheme 3). Molecular weights of the synthesized polymers, determined by GPC, were found to be Mn 23 103, Mw 41 623 for PLA and Mn 16 412, Mw 34 868 for PLA-SEL5%. A small decrease of the molecular weight of PLASEL5% could be due to partial hydrolysis of the polymer, as some reaction steps of the ligand grafting reaction involve acidic or basic treatments. The free ligand was obtained by catalytic hydrogenation of 6, which removed the benzyl protecting groups and gave the ligand described by Wong et al.8, 24 The structure of the free ligand was confirmed by mass spectrometry as well as 1H and
13

C NMR.

Cl

O O BnO BnO

BnO OBn + H N O O O OBn OH

O PLA O O O PLA
n%

(7)
BnO OBn O BnO BnO H N O O O OBn HO

(6)
HO OH O O H N HO O PLA O O O PLA
n%

O

OH

O

O

O

O

O

O PLA O O O PLA
n%

(8)

(9)

Scheme 3.3 Grafting reaction of the synthetic ligand on a PLA chain and deprotection 3.3.3 Preparation and Characterization of NPs. Particle size and zeta potential measurements performed on the NPs used in this study are summarized in Table 1. As expected, no significant differences in zeta potential between bare PLA and PLA-SEL5% NPs were observed due to the low concentration of synthetic ligand in the NPs. The negative surface charge of the NPs is mostly due to the remnant carboxylic groups of PLA.

84

Table 3.1 Particle size and Zeta potential measurements of the different NPs used in this study.

Tested Nanoparticles PLA-Rhod/PLA-SEL5% PLA-Rhod/PLA

Particle size Zeta potential (nm) (mV) 173 � 23 -25.7 168 � 37 -19.2

NP Surface Characterization. We used TOF-SIMS to detect the presence of the ligand directly on the surface of the NPs. For these experiments, no fluorescently labeled polymers were used. Excipients coming from NP preparation and polymers used did not contain any nitrogen atoms. TOF-SIMS is a very surface specific technique and sensitive to the outermost 10 � of the NP surface. In Figure 2, the 40-46 amu region of the mass spectra is displayed, showing peak differences that can be attributed to nitrogen compounds found on ligand-functionalized NPs only.

Figure 3.2 Partial TOF-SIMS spectrum (40-46 amu). (A) NPs made of PLA; (B) NPs made of PLA and PLA-SEL5% (50:50) and (C) NPs made of PLA-SEL5% alone. Significant peaks are identified by arrows. 85

NP Cytotoxicity Studies. Cytotoxicity of NPs made of PLA or PLA- SEL5% was investigated in vitro on two different cell lines, namely, rat macrophages (Raw 264.7) and human vascular endothelial cells (Figure 3A,B). Blank experiments showed no significant polymer absorbance in the concentration range studied. Results of MTT assay demonstrated that the NPs are nontoxic in concentration lower than 100 μg/mL. Moreover, microscopic observations of the macrophage or human vascular endothelial monolayer during the study showed no changes in cell morphology or growing patterns (data not shown).
A % Cell proliferation 120 80 40 0 0.01 0.1 1 10 100 1000

NPs concentration (�g/mL)

B % Cell proliferation 120 80 40 0 0.01 0.1 1 10 100 1000

NPs concontration (�g/mL)

Figure 3.3 Cytotoxicity assays of NPs on endothelial cells and rat macrophages. (A) NPs suspended in PBS were incubated with Raw 264.7 murine macrophage cell line; (B) NPs were incubated with HUVEC □: NPs bearing the synthetic ligand; ♦: NPs made of PLA only. Lines are guide for the eye. 3.3.4 Binding capacity of the NPs in vitro. Selectin expression by HUVECs incubated with pro-inflammatory drugs was characterized by fluorescence microscopy. The relative concentration of E- and P-

86

selectins on HUVEC surface was quantified using fluorescent anti-E-selectin and antiP-selectins mAbs and normalized to basal concentrations on control cells (Figure 4).

3.5 Normalized Fluorescence Intensity 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

* * **

LPS L-NAME

**

E-Selectin

P-Selectin

Figure 3.4 Normalized E and P-selectin expression quantification from fluorescence microscopy in response to LPS and L-NAME activation (p < 0.01, n = 3). Fluorescence intensity per cell was quantified and normalized to basal expression.

Upon incubation with LPS, E- and P-selectin concentrations could be enhanced 3- and 2-fold, respectively. Incubation of cells with the drug L-NAME leads to lower expression of the receptors but was still significantly higher than control cells. Fluorescence micrographs also evidenced differences in E-selectin distribution on the surface of activated cells dependently of the activating drug (Figure 5). P-selectin stained with anti-P-selectin mAbs appeared to be uniformly distributed around the cell nucleus independently of the activating drug (Figure 5B,E). E-Selectin exhibits a very different distribution pattern depending on the activating molecules. With LPS activation, a large fraction of the proteins are uniformly distributed on cell surfaces, (Figure 5C), while with L-NAME, a significant amount are clustered in filamentous structures (Figure 5F).

87

A

B

C

Control D

P-Selectin E

E-Selectin F

Control

P-Selectin

E-Selectin

Figure 3.5 Fluorescent micrographs of HUVECs activated with LPS (B and C) and with L-NAME (E and F). Significant localisation of fluorescence was observed for Eselectin induced by L-NAME compared to LPS while LPS activated cells demonstrate higher level of E and P-selectin on their surface. Control experiments represent Eselectin (A) and P-selectin (D) expression under basal conditions.

Cytoskeletal staining with anti-F-actin mAbs was done to ensure that cell membrane permeability was not increased by formaldehyde treatment. To determine the binding capacity of NPs to HUVECs expressing basal or high levels of selectin receptors, cells were treated with NPs for 5 min at 4 �C in order to decrease uptake by active endocytosis. After this short incubation, cells were abundantly washed and the concentration of bound NPs was quantified at 25 �C by fluorescence photospectrometry (Figure 6). For cells incubated with LPS, NPs formulated with PLASel5% present a 2fold enhancement of bound concentration compared to nonactivated cells and a 30% enhancement for cells incubated with L-NAME. NPs formulated with PLA were not sensitive to expression levels of selectins and exhibit a constant but low bound NPs concentration independently of the experimental conditions. The level of NPs bearing the synthetic ligand corresponds well with the level of expression of E- and P-selectin induced by LPS and L-NAME, indicating that adhesion of these NPs is strongly dependent on selectin expression. 88

Binding NPs Concentration (ug/mL)

60 50 40 30 20 10 0

NPs without ligand NPs with ligand

* *

*

Control

L-NAME

LPS

Figure 3.6 Fluorescence spectrophotometry demonstrates that binding of the NPs is regulated by receptor expression. The concentration of bound NPs on the cells surface was dependent on the activating molecule and was maximum for LPS (p < 0.01, n = 3). NPs binding time was 5 min at 4 �C followed by extensive washing and cell lysis.

Fluorescent micrographs of cells activated with LPS confirmed this result. Strong fluorescence localized on the whole surface of the cell was observed after just 5 min of incubation with NPs bearing the synthetic ligand, while almost no fluorescence could be observed with the NPs formulated with PLA (Figure 7). Control experiments of Factin staining on permeabilized and nonpermeabilized cells were also realized and confirmed that the observed fluorescence in micrographs came from cell surfaces and not from cytosol.

89

A

B

C

PLA-Rhod / PLA D E F

PLA-Rhod / PLA-Sel5%

Figure 3.7 Fluorescence microscopy was used to assess localization of the NPs (red) on LPS activated cell surface. Images confirmed that NPs bearing ligand molecules rapidly adhere to the cell surface (E) compared to the bare NPs (B). NPs binding time was 5 min at 4 �C and was followed by extensive washing and fixation of the cells. (A) and (D) are DIC images, (C) and (F) are merged images. Binding assay of NPs in the presence of free ligand was also realized. Free ligand was incubated for 30 min with HUVEC, which were activated with LPS or L-NAME. They were cooled to 4 �C prior to the introduction of the NPs. An increase of the free ligand concentration was followed by a decrease in the fluorescence intensity only for the NPs bearing the synthetic ligand (Figure 8). Fluorescence intensities similar to those of control cells, which were not activated or incubated with the free ligand, were obtained for free ligand concentrations higher than 10 μg/mL. NPs formulated with PLA were not sensitive to the presence of free ligand in the whole range of concentration studied.

90

Normalized Fluorescence Intensity

2.5

NP-L/LPS NP/LPS

NP-L/LName NP/LName

2

1.5 1

0.5

0 0 0.1 1 10 100

Free Ligand (μg/mL)

Figure 3.8 Fluorescence spectrophotometry demonstrated that free ligand can inhibit binding of NPs bearing ligand molecules (p < 0.01 n = 3). Binding of bare NPs was not affected. NPs binding time was 5 min at 4 �C and was followed by extensive washing and cell lysis.

3.4 Discussion
The natural ligand of E- and P-selectin, the tetrasaccharide sialyl Lewis x (sLex), has a weak affinity (around 0.6 mM) for E-selectin as determined in cell-free assays.25 Development of synthetic carbohydrate ligands having higher affinities has been hindered by the fact that the synthesis of modified carbohydrate is complex and expensive. Moreover, most proteins bind carbohydrates with weak affinity. At a molecular level, X-ray diffraction analysis of E- and P-selectin21 binding sites of natural ligand sLex had recently shown the essential chemical groups involved in the binding pocket. Consequently, several designs of antagonist ligands have been proposed
8, 9

.

Among them, carbohydrate mimetics of sLex based on a mannose ring have been extensively studied.24, 26 The advantage of these molecules is the relative ease of their synthesis and their high affinity toward E- and P-selectin. The binding pattern and conformation of the synthetic ligand grafted to a polymeric chain of PLA was evaluated and compared to the free synthetic ligand. Docking experiments performed on the free

91

synthetic ligand showed that one of the anomeric hydroxyl functions present at the 6-O position of the α-D-mannopyranosyl ring is nonessential for the binding of the ligand. Thus, it could be possible to graft a polymeric chain at that position. The simulation results showed that grafting the synthetic ligand to a hydrophobic polymeric chain like PLA did not alter significantly the interaction pattern of the ligand with the protein. This is in agreement with previous experimental observations made by Wong et al. who showed that conjugation of hydrophobic groups like C16 alkyl chains on the nonessential hydroxyl group of the ligand strongly increased the affinity of the ligand to E- and P-selectin.24 The technique used to evaluate the NPs allows mixing of functionalized and nonfunctionalized PLA chains and offers the possibility of adjusting the concentration of ligand in the NPs. This versatility in the formulation has also allowed encapsulation of hydrophilic27 or hydrophobic drugs28 in PLA NPs and finetuning of the delivery kinetics of these drugs. An important advance of the present approach resides in the fact that, by mixing a ligand functionalized polymer with a nonfunctionalized homologue, a high concentration of ligand on the NP surface can be maintained during the whole lifetime of the NPs, contrary to NPs that are surfacefunctionalized only.29 As already mentioned, the presence of the synthetic ligand on the NPs is a key factor to ensure strong affinity of the NPs to their target. TOF-SIMS results ensured that functionalized NPs really exposed the synthetic ligand on their surfaces. Cytotoxicity assays did not reveal any toxicity associated with NPs over a large range of NP concentrations, ensuring that binding of NPs was not affected by the chemical components of the polymers. Under normal conditions, both E-selectin and Pselectin are present in low concentrations in vascular endothelial cells but can be induced by interleukins (IL), tumor necrosis factor-α (TNF-α), lipopolysaccharides, endotoxins,30 and cytomegalovirus infection.31 Expression of E- and P-selectin by LNAME has been used in model systems of ischemia or artherosclerosis, as it has been reported to inhibit the production of nitric oxide from endothelial cells. Our observation showed that the concentration and the distribution of E-selectin following L-NAME activation and LPS activation in HUVECs are very different. E- and P-selectin levels are higher on cells stimulated with LPS after 4 h of induction. Maximum expression of selectin on the cell surface has been reported to be at 4 h for both LPS and L-NAME

92

activation 32, 33, suggesting that the differences observed in selectin concentration do not come from different expression kinetics. We observed marked differences in selectin distribution on endothelial cells activated by L-NAME or LPS. Scholz et al. reported a more diffuse pattern of E-selectin distribution on HUVEC cells activated by IL-β.34 This suggest that receptor distribution on the cell surface is strongly dependent on the stimulating molecule and therefore on the regulation process. More experiments are needed to truly characterize the effect of the protein distribution on the adhesive capacity of the NPs, but it can be advanced that this factor is expected to strongly affect the adhesive properties of the NPs as already suggested by other studies. Indeed, it has been reported that the location of the ligand-receptor bond relative to the endothelial or particle surface influences the adhesion of NPs to the endothelium.35, 36 Results from in vitro adhesion tests demonstrated that the presence of the ligand was necessary to achieve strong adhesion between cells and NPs. Given that the NPs used in this study have the same particle size and similar zeta potentials, differences in binding properties of the NPs could be directly correlated with the presence of the ligand on NP surface. We observed that NP binding was modulated by selectin upregulation. Indeed, different levels of selectin expression could be achieved by incubating the cells with different pro-inflammatory drugs. These differences in receptor expression could be correlated with differences in binding concentrations for the NPs bearing the synthetic ligand. In a nutshell, these results obtained in vitro confirm the adhesion capabilities of NPs functionalized with selectin ligand, which makes them good candidates for active targeting of the endothelium. Such findings provide important information regarding possible treatments of acute inflammation using drug delivery systems.

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96

CHAPITRE 4 Direct measurement of Mechanical and Adhesive Properties of Living Cells using the Surface Forces Apparatus

ABSTRACT The adhesive and mechanical properties of living cells assembled into a monolayer on two different substrates were investigated using the surface forces apparatus (SFA) technique. The force measurements allowed elastic and bending moduli of the cells plated on substrates to be determined. The moduli are in good agreement with data reported in the literature for single cells determined using atomic force microscopy. Results confirm that the nature of the cell–substrate interactions can mediate cell mechanical and adhesive properties.

4.1 Introduction
Cell attachment to a surface represents a crucial step in several biological processes such as wound healing, cell differentiation, cell migration, tissue organization, or immunological response. Understanding the phenomena that underlie cell–substrate interactions as well as the effect of the substrate on the mechanical properties of cells are key factors for designing and functionalizing a wide range of biomaterials. From a molecular point of view, cell–surface interactions involve both specific and non-specific interactions. Specific interactions such as bio-specific, lock-and-key, and ligand–receptor are short ranged (typically of the order of several tenths of

97

nanometers), are strongly dependent on the chemical structure of the interacting molecules, and may progress in time and space. Non-specific interactions, such as electrostatic and van der Waals interactions can act on a much larger distance scale (typically several hundreds of nanometers) and are less sensitive to the chemical structure of the interacting bodies. From a macroscopic point of view, interactions of cells with a substrate depend on the chemical and physical properties of the substrate, such as its chemical structure,1 roughness,2-4 geometry,5,
6

mechanical properties,7 and wettability.8 These properties

regulate cell adhesion to surfaces and alter cell behavior. For example, it has been shown that the stiffness of polymeric surfaces can regulate stem cell lineage speciation9 or nanoparticle uptake by endothelial cells.10 It is well known that cell–surface interactions are not considered passive processes and are able to trigger a cascade of biochemical signals in and out of the cells. These biochemical mechanisms allow the cell to ‘sense’ its environment and to consequently adapt its behaviour and, more particularly, its mechanical properties to external stimuli.11 The regulation of the mechanical properties of living cells is a very dynamic process and is known to be driven by actin cortex remodeling. The structure and stiffness of the cellular actin network are believed to be responsible for the cell mechanical elasticity.12 Several studies that use techniques such as atomic force microscopy (AFM)13-16 and similar techniques17, 18 have assessed either mechanical or adhesive properties of single cells deposited on a substrate but very few have focused on correlating cell–substrate interactions to cell mechanical properties. To our knowledge, only one study that simultaneously assesses adhesive and mechanical properties of single cells, using reflection interference contrast microscopy (RICM), has been reported in the literature.19 In this study, the effect of the membrane bending elasticity on the adhesion energy was investigated by comparing the adhesion energy of different cells with the same substrate. The low membrane bending modulus of talin-deficient cells compared with wild-type cells was associated with a decrease in cell–substrate adhesion energy. The decrease in cell adhesion energy of talin-deficient cells was ascribed to an increase in thermally induced membrane undulations.

98

Most of the techniques used to investigate cell properties have the same drawback of being limited to local measurement on isolated or single cells. However, a cell monolayer represents a better model to assess mechanical properties of complex tissues than single isolated cells.20 Surprisingly, measurements of adhesive and mechanical properties of cell monolayers have received little attention. In this study, we propose an approach that consists of measuring the mechanical and adhesive properties of living cell monolayers plated on substrates using the surface forces apparatus (SFA). We used macrophage cells that play a central role in immune response. Upon molecular interaction recognition with an external stimulus or infectious agent, these cells undergo a cascade of biological and chemical responses, which cause morphological changes to the cells. Because macrophages are very sensitive cells, their interactions with different substrates are expected to trigger different biochemical responses, which might affect their adhesive and mechanical properties. To investigate the effect of cell–substrate interactions on the resulting adhesive and mechanical properties of macrophage cells, we used two different substrates; poly(llysine) polymer (PLL) and fibronectin proteins (FN) grafted on mica substrates. Living cells are known to interact non-specifically with PLL, whereas specific interactions control their adhesion withFNsubstrates. These different cell–substrate interactions are expected to trigger different biochemical mechanisms, and therefore, to affect the cell mechanical and adhesive properties differently.

4.2 Experimental procedures
4.2.1 Materials Glutaraldehyde, N-aminopropyltriethoxysilane (APTES), poly(l-lysine) (PLL, 190 kDa), and salts (NaCl, KH2PO4, and Na2HPO4) were purchased from Sigma Aldrich(Oakland, ON, Canada) and used as received. Human FN was purchased from CHEMICON. Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) and fetal bovine serum were purchased from Invitrogen Corp. MilliQ quality water was obtained from a

99

Millipore Gradient A 10 purification system (resistance 18.2M / cm, TOC = 4 ppb). Ruby mica sheets were obtained from S & J Trading Inc., USA. 4.2.2 Chemical grafting of APTES and glutaraldehyde onto mica surfaces Muscovite mica is the most suitable substrate for surface forces measurements using SFA because it can be cleaved into very thin, transparent, and molecularly smooth layers required for optical distance measurement. However, mica is chemically inert and requires activation of silanol groups in order to covalently attach any molecule onto its surface. Therefore, mica surfaces were first plasma activated under a water/argon atmosphere according to the methodology developed by Liberelle et al.21 Immediately after plasma activation, mica surfaces were transferred into an evaporation chamber under vacuum (1.6 mmHg) for subsequent reaction with APTES as previously described in the literature.22-25 The evaporation chamber was connected by a valve to a small glass reservoir that contained 100μL of APTES. After purging the chamber for 15 min, the valve was opened to allow APTES vapors to react with activated mica surfaces. During this step, the vacuum was maintained in order to ensure a constant flux of APTES vapors in the chamber and to avoid condensation of the silanes on the activated mica surfaces. Evaporation was allowed to proceed for 4 h. The valve was closed and remnant APTES vapors were pumped out for two more hours. APTES covalent grafting was completed by annealing the surfaces for 1 h at 120◦C under atmospheric pressure. The surfaces bearing APTES were then immersed in a 1% (w/w) water solution of glutaraldehyde for 8 h where a coupling reaction between the APTES amine function and the glutaraldehyde carbonyl function took place.26, 27 The resulting glutaraldehyde-functionalized mica surfaces were thoroughly rinsed with MilliQ water before use.

100

4.2.3 Chemical grafting of FN and PLL onto glutaraldehyde-functionalized mica surfaces FN was chemically grafted onto glutaraldehyde-functionalized mica surfaces by adsorption from a 5μgmL−1 solution in sterile phosphate buffer saline (PBS, 136 � 10−3M NaCl, 1.4�10−3M KH2PO4, 17 � 10−3M Na2HPO4) at 4 ◦C for 8 h. PLL was grafted at ambient temperature from a 0.1 mgmL−1 aqueous solution. Amine functions present on FN and PLL can quickly react with pendant aldehyde moieties present on glutaraldehyde-functionalized mica surfaces to form a covalent bond. After the grafting reaction, the surfaces were thoroughly rinsed with cold sterile PBS. 4.2.4 Cell culture and cell monolayer formation on functionalized mica surfaces Murine macrophage cells RAW 264.7 were cultured in Gibco’s DMEM (4500 mgmL−1 d-glucose, without l-glutamine) supplemented with 10% fetal bovine serumand1 % penicillin–streptomicin at 37◦C and 5 % CO2 atmosphere. Cells were used between passages 7 and 14. Once 80 % of cells confluence was reached in the culture flasks, cells were scrapped and suspended in serum free DMEM solution at a concentration of 1.8 � 106 cells mL−1. Two functionalized mica substrates were placed in a 24-well cell culture plate and rinsed several times with PBS. One milliliter of the cell suspension was added dropwise onto one of the two substrates and the culture plate was placed in the incubator for 3 h. 4.2.5 Optical microscopy The surfaces covered with cells were analyzed using an optical microscope (Zeiss, Germany) in order to visualize the shape of the cells and to determine the surface density of cells. Images were recorded using a 10X objective and analyzed using NIH ImageJ software. Ten separate images were analyzed for each substrate and the data were statistically combined to determine the mean cell surface density.

101

4.2.6 SFA measurements For use in the SFA, mica surfaces were first back silvered, and glued onto two cylindrical silica disks of curvature radius r = 2 cm, mounted in a crossed cylinder configuration. Briefly, the SFA enables the force as a function of surface separation between the surfaces to be determined by measuring the deflection of a variable stiffness spring that supports the lower disk. The distance between the back-silvercoated mica substrates was controlled with a positioning mechanism for displacing the lower surface and was measured by an interferometric technique that uses fringes of equal chromatic order (FECO).28,
29

The directly measured force F between two

identical cylindrically curved surfaces can be related to the free energy of interaction per unit area between two infinite flat surfaces W, using the Derjaguin approximation: 30 F(D) = πRW(D) (4.1)

where F is the interaction force between the two surfaces, D the separation distance, and R the curvature radius of the mica surfaces supported by the cylindrical disks. R was determined using FECO fringes. The separation distance between the surface D was determined using the two adjacent fringes approximation29 to allow a determination of D with 1 % of error. The resolution in measuring force was 0.1mNm−1. In a typical experiment, the surface covered by the cell monolayer was transferred from the incubator into the SFA chamber on the lower disk support and the chamber was filled with sterile PBS at 37.2◦C. The second surface was installed on the upper disk support and the SFA chamber was closed and allowed to reach thermal equilibrium for 1 h. For compression experiments, the two surfaces, initially far apart from each other, were slowly brought into contact by steps of 0.5 μm with an average approach velocity of 50 nm s−1. After each compression experiment, the surfaces were separated at a constant velocity and fringe positions were monitored in real time. Surfaces suddenly jumped out when the restoring force of the cantilever was larger than the attractive

102

force between the surfaces. This resulting measured force, i.e., the force necessary to detach the two surfaces at a given separation velocity, is called rupture force. Each measurement was repeated three times for both compression and decompression profiles. The reference distance, D = 0, corresponds to bare mica– bare mica contact in air. Since the refractive index μ of the medium between the two surfaces cannot be measured simultaneously with D using the approximate method for distance measurement, the value of μ was arbitrarily fixed. The refractive index of living cells can be very difficult to determine because of their complex organizational structure. Different approaches have been proposed to model optical properties of cells. The particle approximation, based on the optical contribution of the nucleus, the organelles, and the intracellular fluid, is generally used.31 According to this approximation, the cell is considered as a spherical scatterer with a mean refractive index of 1.39. 4.2.7 AFM measurements Surface analysis of the functionalized substrates were performed in tapping mode on a Multimode Dimension 3100 atomic force microscope with a Nanoscope IIIa controller (Digital Instruments). Aluminium-coated silicon tips from NanoWorld (ARROW-NCR-20) with a force constant of 42 Nm−1 and a resonance frequency between 270 and 290 kHz were used for all scanned samples. Data analysis was performed using the NanoScope III software (version 5.12r2).

4.3 Results and discussion
FN and PLL were grafted on glutaraldehyde-coated mica surfaces as reported in the literature32 and as detailed in Experimental section. AFM characterization was performed on functionalized (glutaraldehyde) and non-functionalized substrates in order to assess the attachment strength of FN and PLL on the glutaraldehyde-coated mica surfaces. Both surfaces underwent PLL and FN grafting as described in the Experimental section. The topography analysis and the determination of the root-meansquare (RMS) roughness, illustrated in Figure 1, were performed after thoroughly 103

rinsing the FN- and PLL-coated substrates with MilliQ quality water. Therefore, any residual molecules on the surface are assumed to be strongly attached to the substrate. As reference, freshly cleaved mica surfaces and glutaraldehyde-coated mica surfaces exhibit a roughness of 0.10 and 1.05 nm respectively (data not shown). The values of RMS for the PLL and FN coatings on the glutaraldehydecoated mica surfaces are in agreement with reported values for similar substrates.33,
34

The surface coatings are

significantly rougher on glutaraldehyde-coated mica surfaces compared with freshly cleaved mica surfaces and we can clearly distinguish the presence of molecules on the glutaraldehyde-coated mica surfaces compared with bare mica. These observations indicate the presence of strongly attached PLL and FN molecules on the glutaraldehyde-coated mica surfaces.

On freshly cleaved mica
RMS: 0.917 nm

On glutaraldehyde coated mica
RMS: 3.034 nm

FN

RMS: 0.713 nm

RMS:1.426 nm

PLL

104

Figure 4.1: AFM images of PLL and FN coatings on freshly cleaved mica and glutaraldehyde-coated substrates. AFM images were taken in air after thoroughly rinsing the coated substrates with water and drying in air (see Experimental section for details). Scale bar represents 7.5 μm, color scale: 50 nm. Image area size is 30 � 30 μm. Mechanical and adhesive properties of a monolayer of macrophage cells plated on PLL- and FN-functionalized mica surfaces were determined at 310K using SFA as described in the Experimental section. Briefly, the interaction force was measured between a monolayer of macrophage cells plated on a functionalized mica surface and a similarly functionalized mica surface bearing no cells as a function of surface separation distance. A schematic representation of the configuration used for the SFA measurements is illustrated in Figure 2.The optical method used in SFA, which produces a series of fringes known as fringes of equal chromatic order (FECO), allows the simultaneous monitoring of the surface shape, the contact area, the geometry around the contact position, and the homogeneity of the medium trapped between the two surfaces. Optical microscopy was used to monitor the average surface coverage of the cells.

Mica substrate PLL or FN layer PBS, 37�C, pH=7.2

D

Silver layer

Figure 4.2 : Schematic representation of a cell monolayer deposited on a functionalized mica surface. The lower surface supports the cell monolayer and the upper surface, with no cell, is coated with the same material as the lower surface. Also shown, an AFM image of a macrophage cell on an FN-coated mica surface in air (horizontal scale is 25�25μm2, color scale: 2μm).

105

As observed using optical microscopy (Figure 3a), plated macrophage cells adopt a spherical shape of diameter 7.2 � 0.3 μm in a monolayer with a surface coverage of 8.54 � 103 � 900 cells mm−2. The cell height was measured using SFA by considering the onset of the first interaction profile as the contact between the upper surface and the undeformed cells. The onset occurs at 6.10 � 0.05 μm and is close to the cell diameter observed by optical microscopy. Therefore, the cells can be considered as spherical. Figure 3b illustrates the FECO fringes observed when light passes through a cell monolayer for different surface separation distances D, ranging from 8.10 to 3.59 μm. For comparison, FECO fringes obtained for mica–mica contact in air are illustrated in Figure 3c.The presence of the cell monolayer between two mica surfaces alters the shape of the FECO fringes. They become more diffuse, irregular, and broader compared with the FECO fringes observed for mica–mica in contact (Figure 3c) or for homogeneous and very thin films trapped in between surfaces.35 The presence of several spikes on the fringes is attributed to spatial refractive index fluctuations because of the inner heterogeneous structure of the cells. The change in cell shape, as the compression force on the cell monolayer is increased, was monitored by optical microscopy. No protrusion formation is observed (Figures 3a and 3d), which is evidence that cells are not structurally damaged during the course of a compression experiment. Indeed, cell damage caused by compression has been shown to be associated with protrusion formation.36 As illustrated in Figure 3a, the cells progressively deform under compression and they all come in close contact with each other. This regular compact configuration is not observed in the initial state, instead, voids between cells are observed. The cells do not recover their initial round shape after complete separation from contact (Figure 3d) but they rather exhibit an irregular shape while remaining in close contact configuration. The resulting adhesion between adjacent cells after compression is most probably mediated by cadherin extra cellular domains. To assess the mechanical properties of the cell monolayer, we performed a series of compression measurements as described in the Experimental section. In these measurements, the surfaces were slowly brought into contact using 0.5 μm steps (with an average approach velocity of 50 nm s−1) and left to equilibrate

106

a

b 8.10 μm, 0 mN/m

7.00 μm, 0 mN/m

5.07 μm, 0.69 mN/m

3.59 μm, 1.97 mN/m

c

d

Figure 4.3: (a) Microscopy imaging of a cell monolayer under different compression forces, and (b) the corresponding FECO fringes. (c) FECO fringes corresponding to the mica–mica contact in air, (d) microscopy imaging of the cell monolayer after decompression. Scale bars represent 50 μm.

107

between each step until variation of the separation distance was less than 1%. The resulting compression force profile of the cell monolayer between two functionalized mica surfaces immersed in PBS buffer at 37◦C is illustrated in Figure 4. The measured force was normalized by the number of cells using the following approximation: F(D) = Fexp(D) / AintND (4.2)

where Fexp is the experimental measured force, Aint is the effective interaction area corresponding to 2πRD30 for a separation distance D much smaller that the radius of curvature of the surfaces R, and ND is the surface density of cells at a separation distance D. The significant difference observed between the force profiles obtained with PLL and that with FN-functionalized mica surfaces clearly indicates an effect of the nature of the substrate on the resulting cell compression behavior.

1,4 1,2 1,0

Force/cell (10 N)

0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 0 2 4 6 8 10 12

-7

Separation (μm)

Figure 4.4: Compression force profiles of a cell monolayer plated on a FN coated substrate (filled symbols) and on a PLL-coated substrate (empty symbols). Best fitted curves are illustrated for: (—) the capsule model, Eqn 4.3, (– – –) the Hertz model, Eqn 4.5, and (- - - -) the Tatara model, Eqn 4.6. Inset: compression (filled symbols) and decompression force profiles (empty symbols) at a velocity of 6 nms−1 performed on a cell monolayer plated on a PLL-coated substrate. Also represented, the rupture force measured at the jump out transition in the decompression profile.

108

No attractive forces between cell monolayer and functionalized mica surfaces were measured on approach for both substrates, within the limits of our experimental setup, even though attractive interactions between cells and the substrates are expected. Our experimental conditions, more particularly the resolution of distance measurement in the presence of cells between surfaces (approximately 10 nm, see Experimental), did not allow short-range biospecific interactions and electrostatically screened nonspecific interactions to be measured. The range of these interactions is much smaller than the distance resolution of our experimental conditions. The force profiles were analyzed using three different mechanical models. The first model considers a cell as a capsule made of an elastic membrane and filled with an incompressible liquid.37,
38

Therefore, the two main contributions to the compression

force are the stretching and the bending forces of the peripheral membrane. The total force F can be expressed as follows:37 F = Fstreching + Fbending = 2π
1 Em E hR0δ 3 + π m h 2δ 2 1-ν m 2 2

(4.3)

where Em and νm are the Young modulus and Poisson ratio (0.5 for incompressible materials) of the membrane, respectively, h is the thickness of the membrane (4 nm for a cell membrane), δ is the relative deformation defined as 1−D/2R0, and R0 is the cell radius (3.05μm, which corresponds to half the onset of interaction in the force profiles). One drawback of this model relies on the fact that the capsule is assumed to remain non permeable under compression. We used a simple permeability test, using trypan blue dye,37 to confirm that macrophage cells in the monolayer were impermeable at rest (under no applied force). However, this test has not yet been completed for cells under compression. The capsule model can fit our data relatively well for both substrates over all deformations (Figure 4) so that the Young and bending moduli of the membrane, Em and Km, were extracted from Eqn 2 and from the following expression:39

109

Km =

Em h3 2 12(1 −ν m )

(4.4)

The resulting moduli are summarized in Table 4.1. The Young and bending moduli of the cell membrane measured at 310 K on the PLL-functionalized mica (Em =2.5 MPa and Km =4 kBT) are slightly smaller than values reported in the literature for T-cells deposited on a similar substrate (Em =10–35 MPa and Km =17–52 kBT at 300 K).[27] These differences could be ascribed to the higher temperature used in our measurements as elastic moduli are expected to decrease with temperature elevation. Young and bending moduli measured on the FN substrate (6.5 MPa and 12 kBT) are significantly larger than the values measured on the PLL substrate at the same temperature. Table 4.1 : Mechanical parameters of cells obtained by fitting the capsule model (CM), Hertz theory (HT) and the extended Hertz theory (Tatara model, EHT) to the experimental force profiles Substrate PLL coated substrate Young Modulus (kPa) CM HT 2.5�0.5 � 103 10 � 2 35 � 5 Bending Modulus (kBT)A CM 4�1 12 � 2

EHT 7�2 15 � 3

FN coated 6.5�1 � 103 substrate A T = 310 K

Other mechanical models have been proposed in the literature in order to extract mechanical properties of living cells. A simple model based on the Hertzian contact theory of homogenous elastic spheres is often used. The Hertzian model is valid for small deformations as it treats deformation in the sphere–surface contact area while considering the rest of the sphere undeformed. Moreover, this model assumes no friction at the contact area and no adhesion between the interacting bodies. A wellknown result of this theory is a 3/2 power law dependence of the applied force with deformation δ. 110

F=

3 2E R 2δ 2 2 3 1 −ν

(

)

(4.5)

The Young modulus E was used as a fitting parameter to our experimental data. As shown in Figure 3, the Hertz model could represent the experimental data relatively well for FN and PLL coated substrates up to 30% of relative deformation allowing the Young modulus E, to be estimated. For larger deformations (δ > 0.3), the experimental data significantly deviate from the Hertz model as deformation values are no longer within the limits of the model and as additional internal pressure, which arises from the lateral pressure between highly compressed adjacent cells, is involved. Tatara proposed an extended version of the Hertz model40, 41 that treats small and large deformations and assumes, as in Hertz theory, non-adhesive spheres and no friction at the contact area. However, this model does not relate the applied force to the deformation through simple analytical expressions. Nevertheless, the Tatara’s expressions (Equation 5) can be numerically solved at each deformation γ (which is equivalent to δ in the Hertzian model), assuming a constant Young modulus E: 41
3 1 −ν 2 F 3 1 −ν

γ=

(

)

a3 =

(

4 Ea
2


0

f (a) F

)RF )
3 2

πE

f (a) =

4E 2 (1 + ν ) F

(4.6)
+ 1 −ν 2

(

a2 + 4R2

(

a2 + 4R2

)

1

2

where F is the applied normal load and E the Young modulus of the compressed sphere. Tatara’s model can fit our experimental data relatively well, as illustrated in Fig. 3, using a constant Poisson ratio ν = 0.5 and treating the Young modulus as a fitting parameter. Tatara’s extension of the Hertz model gives a better representation of our experimental data than the Hertz theory over a large range of separation distances

111

for both PLL- and FN coated substrates. Young moduli extracted from Hertz and Tatara models for the PLL coating (10 and 7 kPa, respectively) are in good agreement with reported values of 1–7 kPa using AFM and Hertz theory for rat liver macrophages42 and human umbilical vein endothelial cells43 on similar PLL substrates. Using both Hertz and Tatara models, we obtained a higher Young modulus for cells on the FNfunctionalized substrate (20–35 kPa), compared with that on the PLL-functionalized substrate (7–10 kPa) (Table 4.1). Among the three models used, the capsule model gives a better representation of our experimental data compared with the models based on homogenous elastic spheres. Indeed, the concept of a homogenous elastic sphere is too simple to represent the complexity of living cells. The capsule model would be more realistic but also incomplete since it represents the cell as a ‘balloon’ filled with an incompressible liquid whose mechanical properties are totally neglected. As the cytoplasm is a very complex medium where actin and microtubule filaments continuously undergo remodeling into a complex viscoelastic structure, the mechanical properties of the internal cells should not be ignored for modeling. However, despite the fact that the models used are not perfectly realistic, they can represent our data relatively well and predict the same trend regarding the change in mechanical properties of cells as a function of nature of substrate, i.e., the Young modulus of cells is larger for cells interacting with FN than for cells interacting with PLL. The effect of the substrate on the mechanical properties of cells can be attributed to the different biochemistry mechanisms involved upon recognition of the different cell–surface interactions. FN is known to bind to cellular α5β1 integrin, which is associated with actin filaments within cells through different proteins.44 Cell adhesion on FN substrates is mediated by two different adhesive mechanisms, fibrogenesis and focal contact generation. However, it has been shown that fibrogenesis, which leads to fibrillar adhesion, does not occur for cells on FN covalently attached to a substrate.45 In this situation, integrins form highly tyrosine-phosphorylated focal contacts between cells and the substrate and triggers actin polymerization, leading to an increase in cell elasticity. These focal contacts are known to be directly associated with the termini of actin stress fibers that regulate cell elasticity.46

112

On the other hand, cells interact non-specifically with PLL by electrostatic interactions between extracellular heparin sulfated proteoglycans, which carry electrostatic charges, and PLL.47 As there is no direct evidence that these non-specific interactions can trigger actin polymerization, cells on the PLL substrate are expected to exhibit lower mechanical moduli compared with cells on the FN substrate. As already mentioned, cell mechanical properties are expected to regulate cell adhesion to the substrate.19,
48

In order to determine adhesive properties, we determined the rupture

force between the cell and the substrate by performing decompression measurements at different separation velocities as described in the Experimental section. The initial position of the surfaces corresponds to deformations of δ = 0.5 and δ = 0.4 for PLLand FN-coated substrates, respectively. The force measured at the rupture distance, i.e., the distance at which the surfaces jumped-out of contact, is called the rupture force. The variation of the rupture force as a function of the decompression velocity (or separation velocity) is illustrated in Figure 5.

5

4

Rupture Force (mN/m)

3

2

1

0

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Separation Velocity (nm/s)

Figure 4.5: Variation of the rupture force between the cells and the substrate: () PLL substrate, (○) substrate, as function of the separation velocity. Solid lines are guides for the eye.

113

Three different regimes can be observed for both substrates. The first regime is identified at low separation velocities (vs <5 nms−1) where the rupture force is null. A second regime is observed where the rupture force increases with the separation velocity. Finally, a third regime is reached at large velocities where the rupture force is maximal (4.2 mNm−1 at vs =28 nm s−1 and 0.58 mNm−1 at vs =5 nms−1 for FN and PLLcoated mica surfaces, respectively) and does not depend on separation velocity. It is well known that the detachment dynamics of cells that interact with a substrate by specific interactions is controlled by a protein–protein unbinding process.49, separation velocity has been shown to be associated with bond lifetime.51,
50

The The

variation of the rupture force required for single protein–protein unbinding with
52

apparent rupture force is expected to be negligible and independent of the separation velocity when the velocity of dissociation of FN–integrin bonds is much faster than the separation velocity.52 This is the thermally activated regime of bond dissociation that occurs for vs < 5 nms−1 in our experiments. The protein–protein unbinding approach qualitatively predicts the same unbinding dynamics for parallel multiple bonds.49 There exists an intermediate separation velocity regime for which the rupture velocity of the integrin–FN bond is comparable to the separation velocity. In this regime, the rupture force is expected to strongly depend on the separation velocity as the pulled cells are nearly equilibrated between the binding and unbinding states at any stage in the separation process. The kinetically trapped associated FN–integrin bonds and the repopulation of the bound state on the time scale of the separation determine the rupture force. This intermediate regime can be observed in Figure 5 for intermediate velocities, i.e., 5 to 25nms−1 for the FN substrate. When separation velocities are much larger than the velocity of dissociation of integrin–FN bonds, the rupture force is independent of the separation velocity and mainly depends on the number of adhesive bonds (forced unbinding regime).49 This high velocity regime occurs for vs > 25 nm s−1 in our experiments. The arguments for the protein–protein unbinding process cannot be used to interpret the three different regimes observed for the rupture force–separation velocity relationship for the PLL substrate, as no specific adhesive bonds exist between the cell and the substrate. For non-specific cell–substrate interactions, the adhesion–velocity

114

relationship depends on several parameters such as the geometry and mechanical properties of the interacting bodies. No mechanism has been proposed to explain adhesion–velocity dependency for cells that interact nonspecifically with substrates. However, some studies have shown a similar separation velocity dependence of the rupture force for gels and amorphous polymers, which was associated with a viscous peeling mechanism of energy dissipation.53,
54

The similarity between these reported

studies and our data suggests that viscous peeling is most probably the mechanism that controls cell detachment from the PLL substrate at intermediate velocities. As in the forced unbinding regime, the rupture force is mainly dependant on the number of adhesive bonds and their individual adhesive energy,49 the difference in maximal rupture forces observed between cells on FN- and PLL-coated surfaces can be associated with the different strengths of interaction, or number of bonds, involved for both substrates. Specific interactions being stronger than non-specific interactions could simply explain the difference in maximal rupture force considering a similar amount of adhesive bonds. However, it is also known that membrane bending elasticity can regulate the adhesion between cells and substrates.48 The bending energy at the contact lines, typically 1–20 kBT, is one to two orders of magnitude larger than the typical values of the cell adhesion energy.48 The mechanical rigidity, related to high bending modulus, will prevent the cell from decreasing its contact area with the substrate until the pulling force is large enough to simultaneously break all adhesive bonds (parallel unbinding regime). This unbinding mechanism generates high rupture forces that are expected to be proportional to the number of adhesive bonds in the contact area. On the other hand, a low membrane bending modulus favors membrane deformation and thermal undulation, and both phenomena are known to decrease adhesion.30 In this case, the adhesive bonds are preferentially detached from the periphery of the contact area where the membrane bending occurs. The rupture force will be smaller as the adhesive bonds are broken sequentially at the cell–substrate contact line (peeling regime). These arguments can also explain the difference in maximal rupture forces measured with cells plated on PLL and FN substrates.

115

4.4 Conclusions
Mechanical and adhesive properties of macrophage living cells were directly measured on different substrates using the surface forces apparatus. The bending and elastic moduli of the cells, extracted from different models used to fit our data, are shown to be dependent on the nature of the substrate. Higher moduli are obtained for cells plated on a fibronectin compared with cells on a poly(l-lysine)-coated substrate. The high moduli are attributed to actin polymerization, which is triggered by the recognition of the specific fibronectin–integrin interaction. The absence of actin polymerization for non-specific cell–substrate interactions explains the lower elastic and bending moduli for cells plated on PLL. The adhesive properties of the cells, quantified by the rupture force required to separate the cells from the substrate, are also strongly dependent on the nature of the substrate as well as on the velocity at which surfaces are separated. Moreover, a higher maximal rupture force was associated with higher cell mechanical moduli, which was explained by a more favorable parallel unbinding process of FN–integrin bonds. Our results confirm that cell–substrate interactions can mediate cell mechanical and adhesive properties.

4.5 Internalisation de NPs de PLA par des macrophages d�pos�s sur diff�rents substrats fonctionnalis�s
Cette partie exp�rimentale n’a fait l’objet d’aucune publication. L’objectif de cette �tude est de mesurer la concentration de NPs internalis�es par les cellules macrophagiques RAW 264.7 d�pos�es sur diff�rents substrats de mica fonctionnalis�s avec diff�rents polym�res. Les polym�res choisis permettent de modifier l’interaction entre le substrat et la membrane cellulaire. Le polystyr�ne a �t� choisi comme substrat hydrophobe. La poly-l-lysine a �t� greff�e sur le mica pour interagir avec la membrane cellulaire par interaction �lectrostatique. La fibronectine a �t� aussi greff�e sur le mica pour cr�er une interaction sp�cifique entre la surface et les r�cepteurs membranaires de la famille des integrines de la cellule. Enfin, la surface de

116

mica non fonctionnalis�e �tant n�gativement charg�e, son interaction avec la membrane cellulaire est �lectrostatique et r�pulsive. 4.5.1 Protocole exp�rimental 4.5.1.1 Fonctionnalisation du mica Des disques de mica de 1 cm de diam�tre ont �t� d�coup�s � l’aide d’une poin�onneuse con�ue au laboratoire. Les disques ont ensuite �t� cliv�s pour obtenir des surfaces de mica vierges de toutes contaminations. Le greffage de la poly-l-lysine et de la fibronectine sur les disques de mica s’est fait comme d�crit aux paragraphes 4.2.2 et 4.2.3. Le greffage du polystyr�ne s’est fait suivant la proc�dure d�velopp�e au laboratoire par Beno�t Liberelle.55 Bri�vement, les disques de mica fra�chement cliv�s sont d’abord trait�s au plasma suivant la proc�dure d�crite dans le paragraphe 4.2.2. Une fois activ�s, les disques sont introduits dans une solution de cyclohexane et de polystyr�ne fonctionnalis� en bout de cha�ne avec une fonction chlorodim�thylsilyle (50 μg/mL). La r�action de greffage se fait pendant 2.5 h � temp�rature ambiante en pr�sence de 5 μl de pyridine fra�chement distill�e. Apr�s la r�action, les disques sont retir�s des viales de r�action et plac�s � l’�tuve pendant 12 h � 120 �C. � la fin de cette �tape, les surfaces sont retir�es de l’�tuve et abondamment rinc�es avec du tolu�ne fra�chement distill�. Les surfaces ainsi obtenues poss�dent une rugosit� (RMS) mesur�e par AFM de l’ordre de 0.14 nm et ne pr�sentent pas de d�mouillage du polym�re ou de formation d’agr�gats. 4.5.1.2 Culture cellulaire et internalisation des particules de PLA Les cellules RAW 264.7 ont �t� cultiv�es comme d�crit au paragraphe 4.2.4. Une fois en suspension dans du milieu de culture libre de s�rum, les cellules sont red�pos�es sur les substrats fonctionnalis�s pr�alablement introduits dans des puits de culture cellulaire (plaque de 24 puits). La concentration de cellules � l’�tat suspendue et de 2.106 cell/mL. Les cellules sont laiss�es dans l’incubateur pendant 2 h � 37 �C sous 5 % de CO2. Ensuite le milieu de culture est enlev� et une suspension de NPs de PLA marqu�es � la 117

rhodamine B (voir paragraphe 3.2.5) dans du milieu de culture sans s�rum est introduite (20 μg/μL). Les cellules sont trait�es avec la suspension de NPs pendant 3 h dans l’incubateur et sont ensuite rinc�es et lys�es avec une solution de NaOH 1 M et de Triton X100 � 0.2 % pendant 2 h. La fluorescence du lysat est quantifi�e � l’aide d’un lecteur de plaques (SAFIRE, Tecan, Austriche) � une longueur d’onde de 570 nm � 25 �C. L’intensit� de fluorescence mesur�e dans chaque puit est convertie en concentration de NPs en utilisant une courbe de calibration faite parall�lement dans les m�mes conditions exp�rimentales et sur les m�mes substrats que l’exp�rience d’internalisation. 4.5.2 R�sultats Les r�sultats obtenus sont pr�sent�s � la figure 4.6.

Concentration de NPs internalisees (μg/mL)

4

Mica PS PLL FN

*

2

0

Figure 4.6 : Internalisation de particules de PLA fluorescentes par des macrophages murins d�pos�s sur diff�rents substrats. Mica : substrat de mica fra�chement clive ; PS : substrat de polystyr�ne greff� sur une surface de mica ; PLL : substrat de poly-l-lysine greffe sur une surface de mica ; FN : substrat de fibronectine greff�e sur une surface de mica (* p<0.01, n=3).

118

Il est clair que seul le substrat de fibronectine affecte l’internalisation des NPs. La concentration de NPs internalis�es est deux fois plus importante sur le substrat de fibronectine que sur les autres substrats. La concentration de NPs internalis�es par des cellules d�pos�es sur un substrat de polystyr�ne est identique � celle observ�e sur des cellules d�pos�es directement sur des puits de culture (eux m�me en polystyr�ne).56 Ces r�sultats montrent que la nature chimique du substrat est capable de modifier la capacit� d’internalisation des cellules. L’interaction sp�cifique qui existe entre la fibronectine et les int�grines membranaires favorise l’internalisation des NPs. Ce surcro�t d’internalisation s’accompagne aussi d’une augmentation de l’�lasticit� cellulaire, ce qui prouverait que les deux ph�nom�nes sont li�s. Les possibles raisons de ce ph�nom�ne seront discut�es au chapitre 6.

4.6 References
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8168-8173.

122

CHAPITRE 5 Effect of Mechanical Properties of Hydrogel Nanoparticles on Macrophage Cell Uptake

ABSTRACT Uptake and intracellular trafficking of hydrogel nanoparticles (NPs) of N,N-diethyl acrylamide and 2-hydroxyethyl methacrylate crosslinked with N,N’-methylene-bisacrylamide were studied with a RAW 264.7 murine macrophage cell line. Results show that the uptake rate, the mechanism of internalization and the concentration of internalized NPs are correlated to the NP Young modulus. Soft NPs were found to be internalized preferentially via macropinocytosis, while the uptake of stiff NPs was mediated by a clathrin dependent mechanism. NPs with an intermediate Young modulus exhibited multiple uptake mechanisms. The accumulation rate of the NPs into lysosomal compartments of the cell is also found to depend on the NP elasticity. Our results suggest that the control over mechanical properties of hydrogel NPs can be used to tailor the cellular uptake mechanism and kinetics of drug.

123

5.1 Introduction
Different drug-carrier systems, such as liposomes, polymeric micelles, polymer conjugates and polymeric nanoparticles have been investigated for intracellular delivery of therapeutics. Nanoparticles (NPs) based on crosslinked water soluble polymers forming hydrogels have shown to be very good candidates for drug carriers1 because of their low cytotoxicity2 and their tunable properties such as swelling and mechanical properties which can be controlled by the crosslinking density. Moreover, NPs are relativily stable against biodegradation,3, 4 show excellent transfection capabilities,5 promote uptake by a large number of cell lines2, and can also be used as intracellular nanosensors.6-8 The efficiency of therapeutic carriers for intracellular delivery largely depends on their interactions with cell membrane and the uptake mechanism. Most of NPs are found to be internalized into cells by means of endocytic mechanisms.9 The interactions of carriers with cell membrane can be made specific by using ligands that can bind to their receptors on cell membranes. This biorecognition interaction usually increases the intracellular internalization 9 Physicochemical parameters (i.e. surface charge, NP size, substrate elasticity) of polymer-based carriers have shown to influence the interactions with cells or the intracellular fate of the carriers. For example, surface charge of polyamidoamine dendrimers was found to be a determinant factor of the intracellular trafficking.5 Anionic dendrimers were found to be internalized via caveolae mediated endocytosis while neutral and cationic dendrimers were mostly internalized by non-clathrin and non-caveolae mediated endocytosis mechanism in A549 cells.5 Surface charge of polyD,L-lactic acid (PLA) NPs has shown to strongly affect the intracellular fate in MDCK cells but to a less extent the entry mechanism.10 Both cationic and anionic PLA NPs were found to be mainly internalized by a clathrin dependent mechanism. Only anionic NPs were found in the lysosomal compartments while significant amounts of cationic NPs were found to be exocytosed. Particle size has also shown to affect the uptake mechanism and the intracellular fate.11 Small polystyrene particles (nanometer size) were found to exhibit higher intracellular uptake compared to microspheres. Moreover, the small particles were found to be internalized by murine melanoma cells B16-F10 almost exclusively via clathrin dependent pathway and their intracellular trafficking was 124

found to be microtubule dependent. Larger particles were found to be internalized via caveolae related mechanism and systematically exhibited slower kinetics to reach lysosomal compartments. The elasticity of the cell substrate was recently found to have a significant effect on the uptake of polyplexes by murine MC3T3-E1 preosteoblasts.12 An increase in substrate elasticity led to an increase in the NPs uptake which was correlated with enhanced cell proliferation and survival. In the present study, we investigated the effect of the mechanical properties of hydrogel NPs on the cellular uptake and intracellular fate in murine macrophage cells. Macrophage cells represent a good model system for the evaluation of the cytotoxicity of nanoparticulate vectors and for the investigation of treatments against pathologies related to bacterial invasion as bacteria and pathogens are sheltered from host immune defense system in host macrophages. The mechanical properties of the NPs were controlled by varying the concentration of the crosslinking agent used for the NP synthesis and measured using atomic force microscopy (AFM). The NP elasticity was quantified by the Young modulus. The uptake mechanisms of the different NPs were identified using different inhibitors of known entry routes. The intracellular localization of the NPs was assessed by fluorescence microscopy. Colocalization assays with endosomal and lysosomal markers allowed identifying the intracellular pathways pursued by the NPs after their internalization.

5.2. Materials and Methods
5.2.1 Materials N,N-diethyl acrylamide (DEA) was synthesized as previously described
13

. Unless

stated, all chemical products were purchased from Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada). Solvents used were analytical grade and all other chemicals were commercially available reagent grade. 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) was vacuum distilled prior to use. N,N’-methylene-bis-acrylamide (BIS) was recrystallized twice in hexane. Sodium dodecyl sulfate (SDS) was crystallized in pure ethanol. Amonium persulfate (APS), Rhodamine B, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) were used as

125

received. Water was obtained from a Milli-Q� Gradient System from Millipore equipped with a Quantum™ cartridge. 5.2.2 Nanoparticles synthesis The NPs were synthesized as previously reported 13. The monomers (DEA 90 mol% and HEMA 10 mol%, total amount of 26.5 mM in water), BIS and SDS (0.040 g) were added to 200 mL of Milli-Q� water under stirring followed by nitrogen purging for 30 min at 70 �C. APS aqueous solution (0.120 g in 15 mL) was subsequently added to the reacting medium. The reaction was allowed to proceed for 4 h and then cooled at room temperature before filtering the milky suspension through 2.0 μm Millipore Isopore� membrane filters. The filtrate was centrifuged for 15 min at 15 000 rpm. The polymer NPs were collected and purified by dialysis for 1 week against Milli-Q water. 4 different batches of NPs were prepared using 4 different concentrations of BIS in order to vary the mechanical properties of the nanoparticles. The NPs used in this study are known to be thermosensitive with a lower critical temperature (LCT) value ranging from 23 to 28 �C depending on the monomer concentration 13. All nanoparticles were labeled with Rhodamine B using standard EDC/NHS coupling reactions. After labeling, NPs were centrifuged for 15 min at 15 000 rpm and the supernatant was replaced by Milli-Q� water. The polymer NPs were collected and purified by dialysis in Milli-Q water for 1 week. 5.2.3 Nanoparticles characterization NP suspensions were prepared at a final concentration of 0.1 mg/mL in filtered phosphate buffer saline (PBS) and the particle size distribution was measured using dynamic light scattering with a Nano-ZS Zetasizer (Malvern Instrument Ltd., Malvern, Worcestershire, UK) at 37 �C in back scattering mode. Zeta potential of the NP suspensions was measured in triplicate at 37 �C using the Zetasizer. Surface imaging was carried out in tapping mode using a Multimode atomic force microscopy (AFM) equipped with a NanoScope IIIa controller (Digital Instruments, Santa Barbara, CA). The NPs were deposited by spreading a 20 μl suspension droplet on a freshly cleaved mica surface and stored in 30 % relative humidity (RH) atmosphere 2 h prior to AFM 126

analysis. All images were obtained in air using commercial etched silicon cantilevers with a tip of radius ranging from 5 to 10 nm and a spring constant of 20-100 N/m. Image analysis was performed using the NanoScope III software (version 512r2). 5.2.4 Immobilization of the nanoparticles on mica surfaces The NPs were grafted on modified mica surfaces as described elsewhere create OH groups on their surface as described in detail elsewhere
14

. Briefly, . Plasma

large sheets (1.5 x 4 cm) of freshly cleaved mica surfaces were first plasma activated to
15, 16

activation was performed for 5 min at 40 W using argon and water vapors at a partial pressure of 80 mTorr and 300 mTorr respectively. After the plasma treatment, the mica surfaces were left in the plasma chamber under vacuum (0.5 mTorr) for 5 min. Then, the surfaces were transferred to an evaporation chamber and stored under vacuum (1.6 mmHg). The evaporation chamber was connected via a valve to a small glass reservoir containing 100 μL of APTES. After purging the evaporation chamber for 15 min, the valve was opened allowing APTES vapors to react with activated mica surfaces. Evaporation was allowed to proceed for 4 h. The valve was closed and remnant APTES vapors were pumped out for 2 h. The grafting reaction of APTES was completed by annealing the surfaces for 30 min at 90 oC under atmospheric pressure. Then, the surfaces bearing grafted APTES molecules were immersed overnight in a 1% (w/w) water solution of glutaraldehyde where the coupling reaction between APTES amine function and glutaraldehyde carbonyl function took place in presence of NaBH3CN. The resulting glutaraldehyde functionalized mica surfaces were thoroughly rinsed with Milli-Q water prior to NP deposition. The deposition was performed using the horizontal convective evaporation method
17

. A small drop of a 0.1 % (w/w) NP

suspension (25 μL) was placed between a glass applicator and the treated mica surface prior to substrate translation. As the surface was translated at a fixed velocity, the NP suspension drop could spread on the substrate forming a uniform monolayer of nanoparticles. Final concentration of grafted NPs on the treated mica surfaces was 2.6 � 0.4 NPs / μm2 as determined by AFM imaging. 5.2.5 Mechanical characterization of the nanoparticles

127

Mechanical properties of the NPs grafted on mica surfaces were measured using a Bioscope AFM equipped with a G-type piezotube scanner, Nanoscope IIIa controller, and version 4.43r8 of the Nanoscope software (Veeco Metrology, Santa Barbara, CA). Silicon nitride microlevers with spring constant k = 0.01 N/m were used. Mica substrates bearing grafted NPs were immersed in PBS at 37 �C 1 hour prior to measurement. Localization of the NPs was realized by scanning the surface in contact mode over a 3 � 3 μm2 area. The scanning area was progressively decreased to visualize only one NP in the scanned area. Force curve were measured by approaching the tip to the NP on the surface at a fixed velocity and recording the cantilever deflection. Young modulus was extracted from experimental curves by fitting the force profiles with the Hertz model for a conical indenter 18:

F=

2Etan ( θ ) π 1-ν

(

2

)

δ2

(1)

where F is the indentation force, E and ν are the Young modulus and the Poisson ratio of the NP, δ is the indentation and θ is the half-opening angle of the indenter
19

. One

monolayer of NPs was prepared for each of the different NP batches. Five to ten force profiles were recorded on one single NP and 6 different NPs were analyzed for all surfaces. The Young moduli reported in this study represent the average value obtained from all recorded force profiles.
5.2.6 Cell Culture

Macrophage cells, RAW 264.7 were a kind gift from Dr. J.C. Leroux (Universit� de Montr�al). Cells were grown in complete medium consisting of Dulbecco’s modified Eagle culture medium (DMEM) containing 10 % (v/v) heat-inactivated fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin-G, and 100 mg/mL streptomycin (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) in a 5 % CO2 atmosphere at 37 ˚C. The cells were used between passage 4 and 15.
5.2.7 NPs Cytotoxicity

NPs cytotoxicity was assessed using MTT and LDH assays. Raw 264.7 cells were diluted in complete medium at a final concentration of 5 � 105 cells/mL and plated (100
128

�L/well) on a 96 well-flat bottom microplate (Corning, NY, USA). NPs suspended in 10 �L PBS were added in the wells in triplicate for each different NP concentrations (0 et 100 μg/ml. The plates were incubated for 24 h after which cellular proliferation was assessed by MTT assay. Cell medium was removed and the cell monolayer was washed with PBS. Then fresh medium 90 �L and 10 �L of thiazolyl blue tetrazolium bromide dissolved in PBS (10 mM, pH 7.4) at a concentration of 5 mg/mL and filtered on 0.22 �m sterile filter (Millipore, Bedford NMA USA) were added to each well. After 3 h incubation time at 37 ˚C in 5 % CO2 atmosphere, 50 �L of solubilising solution (Isopropanol, 10 % (w/v) Triton-X 100, 0.1 N HCl) was added to each well to dissolve the dark blue formazan crystals. Absorbance was measured at a wavelength of 570 nm using a microplate reader (SAFIRE, Tecan, Austria). The presence of lactate deshydrogenase (LDH) in the supernatant obtained from proliferation assays was used as an indicator of cell lysis. It was determined using a commercial dosing kit (Sigma, Oakville, ON, Canada). Briefly, after incubation of Raw 264.7 cells with the NPs, 5 �l of cell supernatant were transferred to a new microplate and incubated in the dark with the reaction mixture from the dosing kit for 30 minutes. The reaction was stopped with 0.1 N HCl. Microplates were analyzed using a microplate reader at a wavelength of 450 nm (reference wavelength at 690 nm). Results are compared with positive control wells consisting of 100 % Triton-X 100 lysed cells.
5.2.8 Uptake study

RAW 264.7 cells were plated in 96-well flat bottom plates (2 � 105 cells/well) and allowed to adhere overnight in complete medium. Then, the medium was removed and replaced with DMEM. The cells were then incubated in fluorescently-labeled NP solutions at different concentrations at 37 �C for 2 h. The cells were washed with PBS and lysed with 0.2 % (w/v) Triton-X 100 in 0.2 N NaOH solution. The lysate fluorescence was measured on a microplate reader at excitation and emission wavelengths of 550 and 580 nm respectively. The concentration of internalized NPs was determined from an internal calibration curve. This internal calibration curve, i.e. fluorescence intensity versus NP concentration, was determined in parallel to all experiments using known NP concentrations under the same conditions of incubation followed by cell lysis without washing the cells with PBS. The uptake kinetics of the 129

NPs was studied following a similar protocol. For a fixed NP concentration of 70
μg/mL, the cells were treated with the NPs at different incubation times and were lysed

as previously described. To determine the uptake mechanism of the NPs, cells were incubated with endocytic and metabolic inhibitors prior to NPs introduction. The cells were incubated in complete medium in presence of one inhibitor for 1 h and then incubated with the NP solution (70 μg/mL, serum free medium) for 2 h. Cells were washed three times with PBS and lysed. Lysate fluorescence was measured as previously described.
5.2.9 Intracellular trafficking

To establish the intracellular pathways pursued by the NPs, RAW 264.7 cells were plated on round shape cover slips (Fisher Scientific, CA) and incubated overnight at 37 �C in the presence of fluorescein isothiocyanate labeled dextran (DX-FITC, Mw 77000 g/mol, 1 mg/mL in complete medium) as lysosome marker. Then, the cells were washed with DMEM and 8 μL of NP suspension were added to reach a final concentration of 70
μg NPs/mL per well. After 60 min of incubation, the cells were washed with DMEM

and incubated in complete medium for different incubation times allowing intracellular trafficking. Following incubation, the cells were fixed with a 4 % (v/v) formaldehyde solution for 10 min and mounted on glass slides for subsequent fluorescence microscopy. Staining of endocytic vesicles was done as follow. After fixation, the cells were incubated in 250 μL of blocking solution (2 % w/v bovine serum albumine in PBS) for 2h. Then the cells were incubated overnight at 4 oC with goat anti-mouse EEA1 (clone 281.7 from Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) antibody. After washing with PBS, anti-goat ALEXA FLUOR� 488 (Invitrogen, Burlington, CA) secondary antibody was added for 2 h. All samples were analyzed on a fluorescence microscope (Olympus IX71 microscope, Olympus, Markham, ON) using filters optimized for the different fluorescent probes. Images were obtained using an Evolution VF camera (MediaCybernetics, Bethesda, MD) with a 100X objective lens and a constant optimal exposure time. All images were processed with ImagePro� 5.0 (MediaCybernetics, Bethesda, MD) image analysis software. 130

5.2.10 Statistical Analysis

All in vitro experiments were repeated three times and values are presented as the mean � standard deviation. Statistical significance was determined by Student’s t-test.

5.3 Results
5.3.1 Particle Size, zeta potential and morphology

All NPs were synthesized by emulsion polymerization at a constant ratio of 9:1 of DEA:HEMA monomers. Four different batches were prepared using four different crosslinker concentrations ranging from 1.7 to 15 mol% (Table 1). Typical AFM image of the particles deposited on a bare mica substrate at 25 �C is illustrated in Figure 5.1A. All NPs exhibit a round shape and a smooth surface topography. No aggregates were observed for all batches under the deposition conditions used. The NP size measured by dynamic light scattering in PBS at 37 �C, which is well above their lower critical temperature, are reported in Table 1. The particle size is independent of the crosslinker concentration and ranges from 150 to 170 nm.

A

B
A B

100 nm

C

D

Figure 5.1: Surface imaging of the hydrogel nanoparticles (A) deposited from PBS

solution at 37 �C on mica surfaces and analyzed using AFM in air at 25 �C in tapping mode (see methodology for details) (B) NPs deposited on glass slides by self131

adsorption from PBS solution at 37 �C and analyzed using fluorescence microscopy. No particle aggregates were observed under the experimental conditions used in this study. (A) Vertical scale: 100 nm, (B) Scale bar: 5 μm

Zeta potentials of the NPs at 37�C in PBS are also reported in Table 1. The values are slightly negative for all NP batches. However, the variability in zeta potential for such low potentials is known to be ca � 5 V. Therefore, the NP surface potential is assumed to be negligible which is consistent with the fact that only uncharged monomers were used. NPs were also observed by fluorescence microscopy in order to assess their aggregation state under the experimental conditions used for in vitro experiments. NPs suspended in DMEM were deposited on glass cover slips and mounted on slides for fluorescence microscopy analysis. Images shown in Figure 5.1B reveal that the NPs are well organized on the substrate and do not form aggregates. These results confirm the stability of the NPs under the experimental conditions used
5.3.2 Mechanical Properties of the NPs

Young modulus of the NPs grafted on smooth mica surfaces were extracted from force curves measured using AFM in PBS at 37 �C. Only force curves obtained on approach, as illustrated in Figure 5.2, were used to determine Young moduli.

D C

B 0.01 nN 20 nm A

Figure 5.2: Characteristic approach force curves measured using AFM between a

cantilever tip and one nanoparticle grafted on mica surface for the 4 NP batches. The NPs were immersed in PBS at 37 �C for 1 h prior to the experiment. The increase in the slope of the curve in the indentation regime (corresponding to the left part of the force

132

curve) from batch A to batch D corresponds to an increase in Young modulus as described by the equation 1.

The force curves were repeated several times on the same contact point of the particle. The results were reproducible and confirmed the absence of irreversible deformation of the NPs during the indentation. Young modulus of the NPs was calculated by fitting the experimental data into equation 1 considering a Poisson ratio of 0.5 (rubber like material). As illustrated in Table 1, the increase in Young modulus from batch A to D is directly related to the increase in the crosslinker concentration as expected from elastic theory of rubber like materials.20 The Young modulus of the NPs from batch A (1.7 mol % of crosslinker) and batch D (15 mol % of crosslinker) are 18.04 � 4.98 and 211.39 � 43.28 kPa respectively.
Table 5.1 Properties of the hydrogel nanoparticles used in the present study. All measurements were done in PBS at 37 �C

Crosslinker content (% mol) A B C D 1.7 5 10 15

Particle diameter (nm) 169.9 � 13.3 162.1 � 22.8 176.4 � 28.4 153.0 � 35.3

Zeta Potential (mV) -8.06 � 1.02 -10.70 � 1.47 -7.81 � 2.01 -13.6 � 2.30

Young Modulus (kPa) 18.04 � 4.98 35.84 � 10.84 136.28 � 39.55 211.39 � 43.28

5.3.3 Cytotoxicity of the NPs

Cytotoxicity of the NPs was evaluated by MTT and LDH assays in RAW 264.7 cell line. Cells were treated with NPs at different concentrations for 24 h and 72 h. No cytotoxicity, assessed by both assays, could be evidenced for 72 h for NPs from the 4 batches for concentrations lower than 100 μg NPs/mL (data not shown). At a concentration of 100 μg NPs/mL, the cell proliferation remained relatively large for batches A, B, C, i.e.> 85 %, and decreased to 75% for D (Figure 3A). However, the cell 133

lysis remained relatively low for all batches (Figure 3B). Therefore, the NPs from all batches are not considered as cytotoxic. No changes in cell morphology were observed during the experiment which indicates that the presence of NPs did not activate the cells.

A
Cell Proliferation, %
100

50

0 100 80

A

B

C

D

A

B

C

D

24 H

72 H

B
Cell Lysis, %

60 40 20 0

A

B

C

D

A

B

C

D

24 H

72 H

Figure 5.3: Cytotoxicity of hydrogel NPs (100 μg/mL) on macrophage RAW 264.7 cell

line evaluated using (A) MTT and (B) LDH assays. No significant level of cytotoxicity of the four batches of NPs used could be evidenced for NP concentrations inferior to 100 μg/mL.

5.3.4 Uptake Mechanism

Uptake experiments at 4 �C are usually performed in order to stop any energy dependent process like endocytosis in the cell. However, these experiments could not be performed because the NPs are thermosensitive and a change in temperature can give rise to a significant change in NPs size. Thereofore, the uptake mechanism of the NPs was elucidated by treating the cells with endocytic and metabolic inhibitors prior to incubation with the NP solutions. Sodium azide was used at 37 �C as a metabolic inhibitor as it prevents the production of ATP by interfering with the glycolytic and 134

oxydative metabolic pathways of the cell.21,

22

Figure 5.4 illustrates the uptake

concentration of NPs in sodium azide treated cells normalized by the uptake by nontreated cells. Upon treatment, intracellular concentration of NPs for the four different batches corresponds to 40 % of the concentration found in non-treated cells indicating the presence of an active uptake process (Figure 5.4).

Uptake Ratio, %

100 75 50 25 0
Amiloride Chlorpromazine Nystatin Sodium Azide Nocodazole

Figure 5.4 Cellular uptake mechanisms of the NPs assessed by treating the cells with

different inhibitors of endocytic entry routes. The drug concentrations used were: Sodium azide: 100 mM, Amiloride: 200 μg/mL, Chlorpromazine: 200 μg/mL, Nystatin: 100 U/mL, Nocodazole: 5 μg/mL. Cells were incubated with the drug 1h prior to NP treatment. After 2h of NP treatment cells were washed, lysed and lysate fluorescence was quantified. The uptake ratio represents the fluorescence intensity in presence of added drug normalized by fluorescence intensity under control conditions (without added drug) Black: batch A; red: batch B; green: batch C; blue: batch D.

Chlorpromazine was used for the specific inhibition of clathrin mediated endocytosis as it is known to impede the formation and budding of clathrin-coated pits.23 When treated with chlorpromazine, NP concentrations of batches B, C and D correspond to 50 % of the concentration found in non-treated cells while it corresponds to 80 % for batch A. These results indicate that NPs from batches B, C and D were internalized by clathrin mediated endocytosis whereas NPa A were not (Figure 5.4). Nystatin was used to inhibit caveolae mediated endocytosis. This drug is well known to perturb cholesterol rich membrane microdomains which are precursors of caveolae invaginations.21 The cellular uptake of NPs from the batches A and D was not significantly affected by the presence of the drug indicating that none of these particles 135

were taken in by caveolae mediated endocytosis (Figure 5.4). Uptake concentrations for batches B and C were significantly reduced (30 % and 45 % of the concentration found in non-treated cells) in the presence of nystatin which confirms that internalization mechanism of the NPs is partially caveolae dependent. Amiloride is an inhibitor of the Na+/H+ exchange protein and was used to hinder macropinocytosis.24 The cellular uptake of NPs in the presence of amiloride for batches A and B correspond to 45 % and 65 % of the concentration found in non-treated cells respectively. No effect of amiloride was observed for batches C and D. The results indicate that cellular uptake of NPs from batches A and B was mediated by macropinocytosis while NPs from batches C and D were not internalized through this process (Figure 5.4). Nocodazole is known to inhibit microtubules assembly which is involved in intracellular trafficking of vesicles.25 No significant effect of nocodazole treatment on cell uptake was observed for the 4 batches of NPs indicating that their uptake is microtubule independent (Figure 5.4). An experiment was carried out with cells treated simultaneously with NPs (70 mg/mL) and DX-FITC (250 mg/mL) for 1 h allowing internalization of both components within common endocytic vesicles. The cells were fixed after 15 min chasing and analyzed by fluorescence microscopy to determine the colocalization of the NPs with DX-FITC. Figure 5.5 shows that NPs from batches A and B colocalized with DX-FITC in small spherical vesicles. NPs from batches C and D did not present any colocalization with DX-FITC indicating that fractionation between NPs and DX-FITC occurred upon internalization. These results strongly suggest that NPs from batches C and D are not internalized by the same mechanism as DX-FITC.

136

A

B

C

D

Figure 5.5 Fluorescence micrographs of macrophage cells incubated simultaneously for

1 h with DX-FITC (green channel) and NPs (red channel) from batch A to D. After abundant rinsing, cells were incubated with complete medium during 15 min chase. The internalization of DX-FITC and NPs in small spherical vesicles is indicated by the empty arrows. Colocalization of both species is observed for NPs from batches A and B (filled arrows, images A and B) while segregation for NPs from batches C and D is observed (images C and D). Scale bar: 5 m.

5.3.5 Effect of NP concentration on cellular uptake

The cells were treated for 2 h with different NP concentrations ranging from 5 μg/mL to 70 μg/mL. The concentrations of internalized NPs were quantified by spectrophotometry using the internal calibration curve described in materials section. Results, reported in Figure 5.6, show that the concentration of internalized NPs increases monotonically with the initial NP concentration for the 4 batches of NPs. For low initial NP concentrations, no difference in the uptake concentration between the 4 batches of NPs could be evidenced. However, for concentrations larger than 50 μg/mL, batches B and C exhibit larger internalized NP concentrations (18.5 μg/mL and 21.7
μg/mL respectively) compared to batches A and D (15.1 μg/mL and 13.2 μg/mL

respectively). No signs of macrophage activation-like changes in cell morphology were observed during the experiments. 137

30

UptakeConcentration, μg/mL

20

10

0 0 20 40 60 80

NPs concentration, μg/mL

Figure 5.6 Effect of the NPs concentration of the uptake concentration by

macrophage cells (○: batch A; □: batch B; ●: batch C; ■: batch D). Cells were treated with different concentrations of NPs during 2h. After abundant rinsing, cells were lysed and fluorescence of the lysate was determined. Results were converted to NPs concentration using a calibration curve.

5.3.6 Uptake Kinetics

Kinetics of the cellular uptake was studied at 37 �C for a NP concentration of 70
μg/mL. For the 4 batches of NPs, the uptake concentration increases initially linearly

with time and reached a plateau at 2.5 � 0.5 h (Figure 5.7). The initial uptake kinetics is similar for the 4 NP batches. However, the concentrations observed at the plateau are significantly different. Batches B and C exhibit large uptake concentrations (25.1
μg/mL and 24.9 μg/mL respectively) compared to batch A (12.1 μg/mL) and batch D

(12.9 μg/mL).

138

30

Uptake concentration, μg/mL

20

10

0 0 1 2 3 4

Time, h

Figure 5.7: Uptake kinetics of NPs by macrophage cells. Cells were treated with a 70 μg/mL NP suspension for a certain period of time. After rinsing with PBS, cells were

lysed and fluorescence was quantified by spectrophotometry. Results were converted to uptake concentrations using internal calibration. ○: batch A; □: batch B; ●: batch C; ■: batch D.

5.3.7 Intracellular trafficking

NP intracellular trafficking was observed by fluorescence microscopy. As shown in Figure 5.8A, colocalization percentage of the NPs with DX-FITC increases with chasing time, for the 4 batches and reached a plateau after few hours. These results indicate that the compartments containing the internalized NPs are slowly merging with lysosomes and that NPs are not released in the cytosol during their transport. However, noticeable differences in the kinetics of intracellular trafficking are observed between the different batches. NPs from batches B and C reached the lysosomes within 3 h whereas the NPs from batches A and D attained the lysosomes after 6 h. Figure 5.8B shows the localization of the NPs in macrophage cells. The NPs (red channel) are colocalized with DX-FITC (green channel) after 3h of chasing. Following 6h of chasing, NPs from batches B, C and D concentrate in large vesicles where DXFITC molecules are present at the cell periphery.

139

A
Colocalization with nanoparticles, %
100 A B C D

80

60

40

20

0 15 min 1h 3h 6h

Time after Internalization

B A

1h

3h

6h

B

C

D
Figure 5.8: (A) Percentage of colocalization of DX-FITC to rhodamine B labeled NPs,

quantified by fluorescence image analysis and plotted as a function of time after internalization of the NPs. (B) Fluorescence microscopy of rhodamine B labeled NPs in RAW 264.7 cells at different times after internalization. Cells were treated with green marker DX-FITC 12 h prior to the NPs treatment in order to label cell lysosomes. Scale bar 2 μm.

140

Colocalization of NPs with early endosome marker EEA-1 was difficult to assess. The main reason was the rapid trafficking of the vesicles in the cells upon NP internalization as already reported in human hepatocarcinoma cells
25

. However, it was possible to

detect some colocalization spots after 15 min chase exclusively in cells treated with batch D (Figure 5.9). No colocalization of NPs with endosome markers was observed after 30 min chase for the 4 batches of NPs.

EEA-1

NPs A

EEA-1

NPs B

EEA-1

NPs C

EEA-1

NPs D

Figure 5.9: Fluorescence micrograph showing colocalization of NPs (red channel) with

early endosome marker EEA-1 (green channel). Cells were incubated with NPs for 1h and chase for 15min. Cells were washed and fixed and endosome staining was performed using goat anti mouse EEA-1 mAb (see material and method for more details) followed by a secondary antibody (Alexa 488) to reveal vesicles localization. The colocalization mask of the red and green channels is represented in white. From

141

these pictures it can be seen that only NPs from batch D present significant colocalization. Scale bar = 5 μm.

5.4 Discussion
The differences observed in the uptake mechanisms are associated to the mechanical properties of the NPs as the Young modulus is the only physical parameter differentiating the four NP batches. Results show an inhibition of NP uptake in presence of sodium azide for all NP batches suggesting the presence of an active process of internalization. Nanoparticles with low Young modulus were almost exclusively internalized by macropinocytosis while more elastic nanoparticles (batch C and D) exhibited clathrin and/or caveolae mediated entry routes. The highly elastic NPs (batch D) were uptaken mainly by clathrin mediated endocytosis. Previous studies have shown that the physical structure of macromolecules plays a role in determining the cellular uptake mechanism. Ma et al.27 recently showed that free chitosan macromolecules were internalized by Caco-2 cells via caveolae mediated endocytosis while NPs of crosslinked chitosan were internalized via clathrin mediated endocytosis. Chitosan NPs showed larger uptake concentrations compared to free chitosan. Differences in binding and cell uptake between linear and branched polyethylene imines (PEI) were also observed.28 Branched PEI demonstrated five fold greater binding to B16f10 melanoma cells than its linear homologue. Addition of methyl-b-cyclodextrin which sequesters cholesterol inhibiting caveolae mediated endocytosis induced a dramatic decrease in the cell uptake of branched PEI while it increased the uptake of linear PEI. Although the different mechanisms observed were not directly correlated with the differences in carrier size or elasticity, these studies clearly show that the physical structure of carriers affect cellular uptake mechanisms. Differences in the NP uptake concentration are also observed among the different NP batches. NPs with intermediate Young modulus (batch B and C) gave rise to the largest uptake concentrations as they exhibited multiple entry mechanisms. In comparison, the NPs from batch A and D were internalized by only one main entry mechanism and exhibited small uptake concentrations. Significant contribution of macropinocytosis in the entry routes for batch A and B 142

was confirmed by fluorescence microscopy. Cells treated simultaneously with DXFITC and NPs present small spherical vesicles containing both NPs and dextran after 15 min of chase. As DX-FITC is well known to be internalized via macropinocytosis and phagocytosis,29 the existence of a significant number of NPs close to DX-FITC indicates the presence of macropinocytosis for batches A and B. Following cellular uptake, all NPs converged to lysosomal compartments independently of their elasticity. Macropinocytosis and clathrin mediated endocytosis are two mechanisms by which internalized particles can traffic to lysosomal compartments. Caveolae mediated endocytosis does not give rise to accumulation in lysosomal compartments as it is known to be a non acidic and non digestive internalization route.30 Because all NP batches are found to be partly or mainly internalized via macropinocytosis and/or clathrin mediated endocytosis (Figure 5.4), they all converged to lysosomal compartments. Colocalization of NPs with the endosomal marker EEA-1 revealed that NPs from batch A to C were not internalized via endosomal vesicles which is consistent with a non clathrin mediated entry mechanism. Colocalization of NPs from batch D with an early endosomal marker after 15 min chase indicates that internalized NPs were rapidly delivered to sorting vesicles. Addition of nocodazole, which inhibits microtubule dependent transport, has been reported to stop the transport cycle from sorting to recycling vesicles.26 No effect of nocodazole was observed on the uptake of NPs from all batches. Therefore, very low level of partitioning of NPs from early endosomes to recycling vesicles was expected to occur. This is also supported by the fact that all NP batches exhibited similar level of colocalization with lysosomal marker DX-FITC after 6 h chase. It is noteworthy that microtubule independent transport mechanism to lysosomes discards the possibility of uptake by phagocytosis.31, 32 The multiplicity of entry mechanism observed for batches B and C can not be attributed to particle size or aggregation of particles even though it is known that the particle size can strongly affect the uptake mechanism. Recently, it has been reported that particles of diameter lower than 200 nm were preferentially internalized via clathrin coated pits whereas particles of 500 nm diameter penetrated into the cells via the caveolae.11 In the present study, the particle size is not significanlty different between the different NP batches and no signs of aggregation induced by the high salinity of the medium could be evidenced by fluorescence microscopy. NP aggregation in vitro was observed only after 143

2 to 3 h of chase. These observations suggest that neither size variation nor aggregation is the main factor responsible of the multiplicity of uptake mechanism observed for batches B and C. The cellular uptake of the NPs is therefore regulated by their elasticity. The mechanism by which NP elasticity modulates the entry route remains unknown. The dynamics of the membrane-NP interface deformation could play a role in controlling the cellular uptake. As a NP approaches the cell membrane, the thermal fluctuations of the membrane-NP interface could impede the formation of stable contacts and the subsequent receptor recruitment. As soft NPs are expected to deform more easily under thermal fluctuations forces than more eleastic NPs, their binding with cell membrane would be less favorable. Therefore, soft NPs uptake would be expected to be mediated by a receptor independent mechanism such as macropinocytosis while more elastic NPs could trigger receptor dependent internalization.

5.5 Conclusions
In the present study we have investigated the relationship between the mechanical properties of hydrogel nanoparticles NPs, assessed by the Young modulus, and the cellular uptake mechanism and kinetics. All NPs were internalized by an energy dependent mechanism but the endocytic mechanism showed to be dependant on the NP elasticity. Soft NPs were preferentially internalized by macropinocytosis while hard spheres uptake involved the clathrin mediated routes. NPs exhibiting intermediate elasticity were found to be internalized via multiple mechanisms which were correlated with a greater uptake rate. The present study has shown that control over the elasticity of hydrogel NPs can be used to target cellular entry routes. The control of mechanical properties of NPs represents a promising route to design new polymeric drugs carriers with specific subcellular delivery.

5.6 References
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146

CHAPITRE 6 DISCUSSION G�N�RALE

6.1 Le ciblage de la voie endoth�liale
L’�tude des interactions entre nanoparticules, NPs, et cellules vivantes repr�sente un enjeu strat�gique tr�s important pour le d�veloppement de nouvelles formulations th�rapeutiques et pour l’�tude de leur toxicit�. De nombreuses �tudes ont d�j� rapport� l’effet de plusieurs param�tres physicochimiques comme la taille ou la charge superficielle des particules sur leur capacit� de p�n�tration cellulaire. Mais devant la grande disparit� des r�sultats publi�s qui sont souvent contradictoires, force est de constater qu’il est difficile d’�tablir des mod�les ph�nom�nologiques permettant de pr�dire les propri�t�s biologiques des NPs. Ceci est certainement d� au fait qu’il existe encore des param�tres physicochimiques non �tudi�s jouant un r�le majeur dans l’interaction NP-cellule. Dans le but de combler ce vide scientifique, les travaux de cette th�se se sont attach�s � l’�tude de l’effet de la modification des propri�t�s de surface et des propri�t�s m�caniques des particules sur leur capacit� d’adh�sion et de p�n�tration dans les cellules. Dans la premi�re partie de cette th�se nous avons �tudi� l’effet du greffage d’une mol�cule active sur l’affinit� de la NP avec sa cible. Cette mol�cule est connue pour �tre un ligand potentiel tr�s puissant des s�lectines E et P. Le choix de ce ligand a �t� orient� par diff�rents facteurs. Premi�rement le ligand poss�de une affinit� pour les s�lectines E et P sup�rieure � celle du ligand naturel sLex et deuxi�mement sa synth�se implique peu d’�tapes et est relativement simple. Au d�but de ce projet, le ligand choisi pr�sentait les meilleurs caract�ristiques recherch�es mais il est toutefois 147

possible qu’aujourd’hui (7 ans plus tard) d’autres mol�cules aient �t� d�velopp�es pr�sentant une plus grande affinit� pour leur cible et un proc�d� de synth�se plus simple. Le ciblage des s�lectines repr�sente une voie tr�s int�ressante pour le traitement des maladies ayant une composante inflammatoire vasculaire. En effet, il est connu que ces r�cepteurs sont surexprim�s par les cellules endoth�liales du site inflamm�. Une approche classique de la vectorisation consisterait � greffer en surface des NPs un ligand des s�lectines afin d’augmenter l’affinit� des NPs pour cette cible. Cette approche ne garantit aucunement que le ligand restera pr�sent � la surface de la particule une fois inject�e chez le patient. En effet, la pr�sence d’enzymes hydrolytiques dans le flux sanguin est connue pour acc�l�rer le processus de d�gradation des particules de PLA ce qui provoque l’�limination g�n�ralement tr�s rapide du ligand de la surface des NPs. Pour palier � ce probl�me, notre approche a consist� � greffer directement sur le polym�re un ligand peptidique non naturel des s�lectines. De cette mani�re la pr�sence du ligand � la surface de la particule peut �tre garantie tout au long du temps de passage de la NP dans le flux sanguin. Ce polym�re fonctionnalis� est m�lang� avec un polym�re non fonctionnalis� afin d’ajuster la concentration de ligand dans la formulation. Ce m�lange de polym�re sert de matrice pour la fabrication de nanoparticules par la m�thode d’�mulsification / �vaporation de solvant. Nous avons montr� que cette technique permet d’obtenir des nanoparticules arborant une quantit� d�tectable par ToF-SIMS de ligand � leur surface. De plus le ligand greff� sur le polym�re poss�de une affinit� envers ces r�cepteurs sup�rieure � celle de son homologue non greff�. En effet nous avons pu montrer par simulation que la pr�sence d’un segment hydrophobe en alpha du ligand favorise l’interaction avec le r�cepteur. Il est � noter que ces observations ont �t� faites sur la s�lectine E uniquement et nous ne savons pas encore si le greffage du ligand avec le PLA peut affecter la liaison du ligand avec la s�lectine P. L’adh�sion des NPs pour leur cible cellulaire a �t� quantifi�e par microscopie � fluorescence. Nos r�sultats ont montr� que les particules fonctionnalis�es poss�dent une capacit� d’adh�sion sur les cellules endoth�liales in vitro sup�rieure � celle de leurs homologues non fonctionnalis�es. Ceci prouve en partie que la pr�sence du ligand permet bien d’augmenter l’affinit� de la particule pour sa cible. De plus, ces

148

tests ont montr� que la quantit� de NPs adsorb�es est directement proportionnelle � la quantit� de r�cepteurs exprim�s dans un rapport l�g�rement inf�rieur � un. Le fait que le rapport soit inf�rieur � un peut �tre d� � plusieurs raisons. Nous avons montr� que la distribution de selectines � la surface des cellules activ�es n’�tait pas uniforme et qu’il existait des agr�gats de prot�ines tr�s localis�s. Ceci a pour cons�quence directe de diminuer le recrutement des nanoparticules car celles-ci sont dispers�es de mani�re homog�nes dans le milieu de culture et entrent en contact avec le r�cepteur membranaire par diffusion simple. De plus, les nanoparticules �tant sph�riques, leur contact avec la membrane cellulaire ce fait par le recrutement d’un petit nombre de r�cepteurs membranaires. Autour de la zone de contact entre la nanoparticule et la membrane, il existe une zone de la membrane cellulaire non accessible � d’autres particules d� � leur courbure. Cette zone � morte � est un r�servoir de r�cepteurs non accessibles. Des tests d’adh�sion des NPs en pr�sence de ligand libre ont montr� que la forte affinit� des NPs fonctionnalis�es avec le ligand �tait bien due � l’interaction sp�cifique de type ligand / r�cepteurs. La valeur de l’IC50 de la NP peut �tre calcul�e � partir des donn�es obtenues dans cette �tude et compar�e avec celle du ligand libre. Nos r�sultats montrent que l’IC50 de la NP est de 21 μM alors que celui du ligand libre est de 110 μM1 pour la selectine E. A titre de comparaison, l’IC50 du SLex est de 800 μM pour la selectine E et de 8000 μM pour la selectine P. Ces r�sultats montrent clairement que la NP poss�de une affinit� sup�rieure pour le r�cepteur compar� au ligand libre ou au SLex . Ce r�sultat confirme donc les observations faites par simulation mol�culaire qui avaient permis de d�finir le site de greffage du ligand comme tr�s favorable car il poss�dait la capacit� d’augmenter l’affinit� du ligand pour sa cible. Nos r�sultats peuvent �tre compar�s avec d’autres �tudes utilisant d’autres r�cepteurs membranaires aussi surexprim�s par les cellules endoth�liales inflamm�es. Il existe diff�rents exemples de ciblage de ICAM-1 utilisant soit un anticorps anti-ICAM-12 soit un peptide cyclique3. Le ciblage de ICAM-1 en utilisant des particules de PLA fonctionnalis�es en surface avec le peptide cyclo(1,12)PenITDGEATDSGC3 a montr� que les particules fonctionnalis�es poss�daient une affinit� sup�rieure pour leur cible cellulaire compar�e � leurs homologues non fonctionnalis�es. En particulier, il a �t�

149

observ� que lorsque la concentration de r�cepteurs membranaires �tait multipli�e par deux, la quantit� de NPs fonctionnalis�es internalis�es �tait aussi multipli�e par deux. Ce ph�nom�ne a aussi �t� observ� dans notre �tude. En effet, l’activation des cellules HUVEC avec diff�rentes drogues pro-inflammatoires a permis de moduler l’expression des s�lectines E et P. Par exemple, en traitant les cellules avec 10 μg/mL de LPS, le niveau d’expression de la s�lectine E est multipli� par quasiment 3 et l’expression de la s�lectine P est multipli�e par 2. Nous avons montr� que l’adh�sion des NPs fonctionnalis�es est multipli�e par 2.5 sur les cellules activ�es par LPS compar�es aux cellules contr�les non activ�es. La similitude de nos r�sultats avec ceux de l’�tude publi�e par Zang et al.3 sugg�re que l’utilisation d’un ligand peptidique greff� en surface de NPs permet d’augmenter significativement l’affinit� du vecteur pour sa cible. L’efficacit� d’un principe actif encapsul� dans une NPs d�pend grandement de sa distribution intracellulaire. Celle-ci est d�termin�e par le m�canisme d’internalisation emprunt� par la NP pour p�n�trer dans la cellule. Les �tudes ciblant ICAM-1 soit � l’aide d’un anticorps soit � l’aide d’un peptide ont montr� que la NP converge syst�matiquement vers les organelles digestives de la cellule telles que les lysosomes. Nous n’avons pas fait d’�tudes exp�rimentales permettant de d�terminer la localisation intracellulaire des NPs de PLA fonctionnalis�es utilis�es dans notre �tude mais il est fort probable que celles-ci convergent aussi vers les lysosomes. En effet, plusieurs �tudes ont montr� que des vecteurs ciblant les s�lectine E et P sont internalis�s via la voie des clathrines et convergent vers les lysosomes tr�s rapidement.4,
5

L’accumulation des NPs dans les lysosomes peut �tre vue comme un avantage dans le contexte de certaines interventions th�rapeutiques comme les th�rapies de remplacement d’enzyme pour le traitement de pathologie li�es aux lysosomes comme la d�ficience en hydrolase lysosomale. Les r�sultats que nous avons pr�sent�s d�montrent la possibilit� d’utiliser le vecteur d�velopp� pour cibler sp�cifiquement l’endoth�lium inflamm�. Pour tester le vecteur sur un mod�le animal d’inflammation il sera n�cessaire d’effectuer certaines modifications sur la composition du vecteur. En particulier, il sera n�cessaire de greffer en surface de la NP une couche de polym�re hydrophile comme le

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poly�thyl�ne glycol (PEG) capable de diminuer l’adsorption des prot�ines du compl�ment responsables de l’�limination rapide des NPs. En effet, plusieurs �tudes ont montr� que diff�rentes prot�ines comme l’albumine ou IgG6,
7

s’adsorbent � la

surface des NPs tr�s peu de temps apr�s leur incubation dans du plasma humain. Cette modification peut �tre faite tr�s simplement en utilisant le m�me principe que nous avons utilis� pour fonctionnaliser les NPs avec le ligand. Il serait juste n�cessaire de m�langer un polym�re fonctionnalis� avec du PEG avec un polym�re inerte (PLA) et un polym�re actif (fonctionnalis� avec le ligand) pour former la particule. Ce concept est facilement extrapolable � la multi fonctionnalisation des nanoparticules, c'est-�-dire au greffage de multiple mol�cules actives permettant d’augmenter l’efficacit� du ciblage et le captage des NPs par leur cible cellulaire.

6.2 Effet de l’�lasticit� cellulaire sur la capacit� d’internalisation des nanoparticules
La deuxi�me partie de notre �tude s’est concentr�e sur l’effet des propri�t�s m�caniques des cellules sur leur capacit� � capter des particules de PLA non fonctionnalis�es. Pour ce faire, il a �t� n�cessaire de d�velopper une m�thode pour mesurer les propri�t�s �lastiques des cellules. Il existe un grand nombre de techniques capables de mesurer les propri�t�s �lastiques des cellules, c'est-�-dire leur module de Young. Malgr� tout, il n’existe aucune technique capable de mesurer l’�lasticit� cellulaire sur un grand nombre de cellules simultan�ment. En effet, seule la chambre � flux laminaire et la technique d’�tirement de substrat permettent d’analyser les propri�t�s m�caniques d’un grand nombre de cellules simultan�ment mais aucune de ces deux techniques ne permet l’obtention du module de Young. Nous avons donc choisi d’utiliser l’appareil de forces de surface (SFA) pour �valuer les propri�t�s �lastiques de monocouches de cellules d�pos�es sur un substrat fonctionnalis�. Nous avons montr� que la technique permet de mesurer tr�s pr�cis�ment la d�formation appliqu�e aux cellules gr�ce � l’exploitation des franges d’ordre chromatique �gal. La forme des franges d’interf�rence est aussi un indicateur de la g�om�trie du contact entre les deux surfaces en approche. En pr�sence de cellules, nous avons vu que les 151

franges d’interf�rence poss�daient une forme dentel�e tr�s prononc�e � faible compression qui devenait de plus en plus lisse au fur et a mesure que l’effort normal appliqu� augmentait. Ceci traduit un changement de g�om�trie des cellules induit par la force normale appliqu�e. Ce changement de g�om�trie a aussi �t� observ� par microscopie optique. Lorsque la force normale appliqu�e est supprim�e, les cellules ne retrouvent pas leur forme initiale. En effet, la microscopie optique a d�montr� que les cellules gardaient une forme identique � celle adopt�e � haute pression. La forme des franges d’interf�rence ne retrouve pas sa forme dentel�e caract�ristique � pression appliqu�e nulle. Ces observations traduisent une d�formation irr�versible des cellules due � un remodelage du cytosquelette induit par l’application d’une force normale. Comme nous l’avons montr�, ceci n’emp�che pas d’obtenir des valeurs de module de Young qui sont tr�s proches de celles d�j� report�es dans d’autres �tudes utilisant des techniques comme l’AFM. Un des r�sultats tr�s importants de l’�tude est qu’il est possible de modifier l’�lasticit� des cellules macrophagiques par une simple modification chimique du substrat. Les approches les plus utilis�es pour modifier les propri�t�s m�caniques des cellules utilisent des mol�cules en solution (et non greff�es sur un substrat). Par exemple la profiline est connue pour favoriser la nucl�ation et l’assemblage de nouveaux filaments d’actine et aussi de promouvoir la polym�risation de l’actine globulaire. Ceci a pour effet global d’augmenter l’�lasticit� de la cellule. La modification chimique du substrat permet entre autre d’�valuer l’interaction entre les cellules et la matrice extracellulaire et de mieux comprendre le r�le qu’elle joue dans la r�gulation des propri�t�s m�caniques des cellules. Nous avons donc modifi� chimiquement le substrat de mica afin d’y greffer diff�rentes mol�cules biologiques comme la fibronectine et la poly-L-lysine. Ces deux substrats ont �t� choisis car les cellules de type macrophage y adh�rent fortement ce qui permet une manipulation facile des surfaces. D’autres substrats comme des surfaces de mica fra�chement cliv�e ou recouverte d’une couche de polystyr�ne n’ont pu �tre utilis�s pour les mesures au SFA car les cellules n’y adh�raient pas suffisamment ce qui rendait la manipulation des surface tr�s d�licate. Ce probl�me a pu �tre contourn� pour les exp�riences in vitro ce qui nous a permis d’inclure les surfaces de mica et de polystyr�ne dans cette partie de notre �tude.

152

Les r�sultats des mesures d’�lasticit� ont montr� que le substrat de fibronectine provoque une augmentation marqu�e de l’�lasticit� cellulaire. Ceci peut �tre attribu� � la pr�sence dans la fibronectine de la s�quence RGD connue pour �tre reconnue par les int�grines. L’association fibronectine-int�grine d�clenche la formation d’un complexe focal qui pourra �voluer en contact focal. Ce processus s’accompagne de la polym�risation des filaments d’actine et de leur assemblage en bouquets naissants du contact focal. Nos exp�riences ont aussi montr� que le substrat de poly-L-lysine ne provoquait aucune modification de l’�lasticit� cellulaire. Ceci prouve que l’interaction sp�cifique du substrat avec les prot�ines d’adh�sion cellulaire comme les int�grines est capable de modifier significativement la structure m�canique des cellules. Les tests d’internalisation que nous avons effectu�s in vitro avec des particules de PLA non fonctionnalis�es ont montr� que les cellules d�pos�es sur un substrat de fibronectine avait une capacit� � capter les NPs bien plus �lev�e que les cellules d�pos�es sur un autre substrat comme le mica ou le polystyr�ne. Ce r�sultat remarquable est sp�cifique au substrat fonctionnalis� avec la fibronectine et n’a �t� observ� sur aucun des quatre autres substrats que nous avons test�s. Ceci prouve clairement que la pr�sence de fibronectine alt�re une fonction physiologique cellulaire essentielle qui est l’endocytose. Le m�canisme d’entr�e des nanoparticules de PLA dans les macrophages que nous avons utilis�es a �t� report� r�cemment.7 Un traitement des cellules macrophagiques avec une solution de sucrose hyper osmotique, connue pour inhiber l’internalisation en phase fluide, provoque une diminution drastique de l’internalisation des NPs. Il en est de m�me en traitant les cellules avec une solution de chlorpromazine. Ces deux observations montrent que les NPs de PLA p�n�trent dans les cellules RAW 264.7 via un m�canisme clathrine d�pendant et par macropinocytose. Bien que ces r�sultats aient �t� observ�s sur des cellules d�pos�es sur un substrat de polystyr�ne il est probable que ces m�mes m�canismes soient aussi impliqu�s chez des cellules d�pos�es sur d’autres substrats. L’augmentation de la capacit� d’internalisation observ�e sur le substrat de fibronectine pourrait �tre due en partie � une stabilisation des puits mantel�s de clathrine par le r�seau de filament d’actine. En effet, l’internalisation par la voie des clathrine s’initie par la formation de

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puits mantel�s dont la position et la densit� est d�finie par un �chafaudage de filament d’actine r�ticul�e. En absence de cet �chafaudage, les puits mantel�s ne sont pas stables � la surface membranaire et ont tendance � se d�placer rapidement par diffusion brownienne. Le r�seau de filament d’actine permet de fixer leur position et donc de faciliter la capture des NPs. Les r�sultats de cette �tude mettent en valeur l’importance de l’interaction substratcellule sur la capture des nanoparticules. Nous avons montr� que la pr�sence sur le substrat de mol�cules bioactives comme la fibronectine pouvait augmenter significativement l’internalisation d’un vecteur et par cons�quent augmenter son efficacit� th�rapeutique. Dans un contexte pharmacologique, il serait possible d’utiliser ces r�sultats pour d�velopper de nouvelles strat�gies de capture des NPs par leur cible en utilisant le contr�le de la structure du r�seau d’actine corticale.

6.3 Effet des propri�t�s �lastiques des nanoparticules sur leur capacit� de p�n�tration cellulaire
La troisi�me partie de notre projet a vis� l’exploration de l’effet des propri�t�s m�caniques des NPs sur leur capture par les cellules de type macrophage. Pour ce faire nous avons synth�tis� des NPs d’hydrogel thermosensibles poss�dant diff�rents taux de r�ticulation. De cette mani�re, nous avons pu contr�ler le module de Young des particules sur intervalle allant de quelques dizaines � plusieurs centaines de kPa. La mesure des propri�t�s �lastiques des NPs s’est faite en utilisant la technique de nanoindentation par AFM. Cette technique permet de mesurer le module de Young local dans une zone ayant approximativement la taille de la pointe utilis�e (environ 10 nm x 10 nm). Les propri�t�s �lastiques mesur�es par cette technique doivent donc �tre moyenn�es sur toute la NP car la densit� d’agent r�ticulant, et donc les propri�t�s �lastiques, ne sont pas n�cessairement homog�nes sur toute la NP.8 Nos r�sultats ont montr� qu’une augmentation de la concentration d’agent r�ticulant dans la formulation des NPs se traduisait par une augmentation du module de Young mesur� par AFM sur tout l’intervalle de concentration �tudi�. Ceci est en accord avec la th�orie classique de l’�lasticit� macromol�culaire et aussi avec des r�sultats r�cents 154

publi�s sur des macrogels de PLA-PEG9. D’autres �tudes r�alis�es sur des macrogels d’acide acrylique ont montr�es que la relation entre module de Young et concentration d’agent r�ticulant n’est pas lin�aire mais pr�sente un plateau de saturation. L’existence de ce plateau est d’ordre chimique et non m�canique, c'est-�-dire que son apparition est reli�e � la r�activit� des monom�res, sp�cialement de l’agent r�ticulant. Katime et col. ont montr� par exemple que la pr�sence d’acide acrylique (AA) dans la formulation d’un gel d’acide acrylique-co-acrylate de m�thyle r�ticul� avec la N,N m�thyl�ne bisacrylamide (NMBA) limitait la r�activit� de NMBA au del� de 2% de AA.10, 11 Les r�sultats de l’internalisation des NPs par des cellules macrophagiques ont montr� qu’il y avait une forte d�pendance des propri�t�s �lastiques sur l’internalisation des NPs. Ces diff�rences sont li�es aux multiples voies d’entr�e emprunt�es par les particules. En effet, les tests d’inhibitions sp�cifiques ont montr� que les NPs ayant un module de Young de l’ordre d’une dizaine de kPa entrent tr�s majoritairement par macropinocytose. Ce m�canisme d’entr�e est caract�ristique de l’endocytose en phase fluide et est la voie privil�gi�e d’un grand nombre de macromol�cules naturelles comme le dextran. Les NPs ayant un module de Young de quelques centaines de kPa p�n�trent dans les cellules par un m�canisme faisant intervenir la voie des clathrines. Les particules ayant une �lasticit� interm�diaire pr�sentent de multiples voies d’entr�e qui font intervenir entre autre la voie cav�olaire. Cette �volution du m�canisme d’internalisation avec l’�lasticit� de la NPs est sch�matis� � la figure 6.1. Plusieurs hypoth�ses peuvent �tre avanc�es pour expliquer ce ph�nom�ne.

155

Voie des clathrines Voie caveolaire Macropinocytose A B C D

�lasticit�

Figure 6.1 : Repr�sentation sch�matique du changement de m�canisme d’entr�e des NPs d’hydrogel en fonction de leur �lasticit� Il est d’abord possible d’invoquer un m�canisme de m�canosensation. Celui-ci fait intervenir la formation de sites focaux d’adh�sion entre la NP et la membrane corticale (Figure 6.2 A). Ces contacts, facilit�s par l’agr�gation des int�grines, sont directement li�s � la machine contractile de la cellule ce qui lui permet de d�former les NPs et par le fait m�me d’en � mesurer � les propri�t�s m�caniques. Ce mod�le se base sur de nombreuses observations exp�rimentales faites sur les cellules adh�rentes. Les cellules, via leurs sites d’adh�sion, sont capables de d�former le substrat sous jacent en appliquant une tension tangentielle au substrat. Cette tension est g�n�r�e par la machine contractile de la cellule qui induit � son tour la d�formation de certaine prot�ines associ�es au site d’adh�sion et au cytosquelette d�clenchant ainsi une cascade de signalisation qui permettra entre autre de r�guler la tension m�canique appliqu�e sur le substrat. Cela dit, la formation d’un contact focal implique n�cessairement le recrutement des int�grines dont le r�le dans l’endocytose n’a pas �t� report� jusqu’� pr�sent. De plus la taille d’un contact focal � maturit� peut atteindre quelques microm�tres de diam�tre ce qui est tr�s sup�rieur � la taille des NPs que nous avons utilis�es dans notre �tude. Il est donc fort peu probable qu’un m�canisme m�canosensoriel soit � l’origine de l’implication de l’�lasticit� des NPs dans l’internalisation.

156

A
Plaque adh�sive

Filaments d’actine

B

Rec�pteur Membrane Nanoparticule

C

couche d’hydratation

Figure 6.2 : Repr�sentation sch�matique des diff�rents mod�les de d�formation induites lors du contact entre une particule d’hydrogel et une membrane cellulaire. (A) Mod�le consid�rant la formation de plusieurs contacts focaux d’adh�sion sur la NP. La d�formation de la NP est induite par la tension g�n�r�e par les fibres d’actine attach�es � la plaque adh�sive, (B) Mod�le m�canique statique consid�rant l’adh�sion forte de la NP � un r�cepteur membranaire. La concentration de r�cepteurs dans la zone de contact permet d’envelopper partiellement la NP et de la d�former, (C) Mod�le consid�rant la dynamique de l’interface de contact. La NP et la membrane �tant d�formables, une force de fluctuation thermique ou d’hydratation st�rique, s’exerce entre les deux corps limitant leur contact. Une autre approche consiste � supposer que les particules poss�dent intrins�quement une forte affinit� pour la paroi membranaire. Cette affinit� peut �tre due � la pr�sence d’un r�cepteur membranaire ayant la capacit� d’adh�rer fermement � la surface des NPs. Au moment du contact, la NP s’�tale sur la membrane cellulaire d� � sa forte affinit� pour la membrane. Moins la NP est �lastique, plus elle aura tendance � s’�taler

157

sur la membrane. L’�quilibre m�canique de l’interface de contact cellule / NP est atteint lorsque l’�nergie �lastique g�n�r�e par la d�formation de la NP est �gale � l’�nergie d’adh�sion g�n�r�e par l’interaction NP-cellule additionn�e � l’�nergie g�n�r�e lors de la d�formation par flexion de la membrane (voir figure 6.2 B). Ainsi, les NPs peu �lastiques poss�deront une aire de contact avec la cellule bien plus importante que les particules �lastiques et auront une plus grande capacit� � recruter des r�cepteurs membranaires. Cette diff�rence de capacit� de recrutement des r�cepteurs membranaires pourrait �tre � l’origine des diff�rents m�canismes d’entr�e observ�s. Ce mod�le reste malgr� tout incomplet car nos observations ont montr� que les NPs ayant un module de Young de quelques kPa entrent dans la cellule par macropinocytose ce qui �limine l’implication d’un r�cepteur. En effet, la macropinocytose n’implique aucun contact entre la particule et la cellule. Ce mod�le peut �tre affin� en consid�rant cette fois-ci que les NPs molles poss�dent une surface tr�s mall�able. Sous l’effet de l’agitation thermique, la NP se d�forme constamment � l’approche de la membrane cellulaire qui elle aussi ondule de mani�re al�atoire. Ces modifications constantes de l’interface NP-cellule g�n�rent une force dite de fluctuation thermique connue pour �tre de nature r�pulsive.12 L’interface d’interaction �tant peu stable, la formation d’un contact adh�sif et le recrutement de r�cepteurs membranaires sont tr�s peu favoris�s (Figure 6.2 C). Ce ph�nom�ne expliquerait pourquoi les NPs faiblement �lastiques p�n�trent dans la cellule par macropinocytose plut�t que par une autre voie impliquant un r�cepteur membranaire. Les particules tr�s �lastiques maintiennent une interface plus stable au contact avec la membrane ce qui permet le recrutement des r�cepteurs membranaires dans la zone de contact. Selon l’�lasticit� de la particule, l’aire de contact et le nombre de r�cepteurs recrut�s seront plus ou moins �lev�s ce qui d�terminera la voie d’internalisation. Ce mod�le est certainement celui qui est le plus en accord avec nos observations exp�rimentales. En effet, d’apr�s nos r�sultats, les particules ayant un module de Young de quelques centaines de kPa sont internalis�es par les puits mantel�s de clathrine. Cela signifie que cette voie d’internalisation n�cessite le recrutement d’un petit nombre de r�cepteurs. Les particules ayant un module de Young interm�diaire (compris entre 20 et 100 kPa) sont internalis�es par plusieurs m�canismes dont la voie

158

cav�olaire. Toujours d’apr�s notre mod�le, ceci tendrait � prouver que l’entr�e par la voie cav�olaire n�cessite le recrutement d’un plus grand nombre de r�cepteurs que la voie classique des clathrines. Nous avons montr� l’existence de nouveaux param�tres physico-chimiques importants contr�lant l’interaction NP – cellule. L’�lasticit� cellulaire et l’�lasticit� de la NP sont deux nouveaux param�tres qu’il est important de prendre en compte pour la conception d’un vecteur et pour le traitement d’une pathologie. Le contr�le de de l’�lasticit� de la NP permet en autre chose de modifier leur voie d internalisation ce qui est d’un int�r�t majeur pour la lib�ration de mol�cules sensibles comme les prot�ines ou l’ADN. Un vecteur capable d’�viter les voies digestives de la cellule pourrait permettre de d�livrer de l’ADN � l’int�rieur de la cellule sans �tre d�grad�. L’�lasticit� cellulaire est un autre param�tre important � consid�rer pour le d�veloppement d’un vecteur. En effet, nous avons montr� que la cellule cible doit pr�senter des propri�t�s m�caniques ad�quates pour pouvoir maximiser l’entr�e de la NP. Les propri�t�s m�caniques cellulaires sont essentiellement contr�l�es par le substrat sur lequel elle repose. L’�lasticit� du substrat et sa composition sont deux facteurs tr�s importants d�terminant les propri�t�s m�caniques cellulaires. Il est bien connu que certaines pathologies comme le cancer se d�veloppent en modifiant drastiquement le milieu extracellulaire. Nos r�sultats prouvent que le ciblage th�rapeutique de ces pathologie doit n�cessairement tenir compte de � l’�tat m�canique � du milieu cibl� afin de maximiser l’efficacit� d’un possible traitement.

6.4 REFERENCES
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159

4.

Everts, M.; Kok, R. J.; Asgeirsdottir, S. A.; Melgert, B. N.; Moolenaar, T. J.

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(4), 4016-4022.

160

CHAPITRE 7 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Ce projet rapporte l’�tude des propri�t�s physico-chimiques de nanoparticules � usage pharmaceutique et leur impact sur l’interaction avec les cellules vivantes. Pour ce faire nous avons explor� l’effet de trois propri�t�s distinctes : l’effet du greffage en surface d’une mol�cule active permettant de cibler un r�cepteur cellulaire, l’effet des propri�t�s �lastiques des cellules sur leur capacit� d’internalisation et enfin l’effet des propri�t�s �lastiques des nanoparticules sur leur capacit� de p�n�tration cellulaire. Pour �tudier l’effet du greffage d’une mol�cule active en surface de la NP, nous avons d�velopp� une nouvelle m�thode de greffage du ligand qui garantie sa pr�sence � la surface du vecteur durant toute sa dur�e de vie. Les tests in vitro sur des cellules endoth�liales ont montr� que les NPs formul�es avec le polym�re fonctionnalis� avaient une affinit� accrue pour les cellules activ�es compar�es aux NPs formul�es avec du PLA seulement. Des tests de comp�tition entre les NPs fonctionnalis�es et le ligand libre ont montr� que cette augmentation de l’affinit� des NPs fonctionnalis�es �tait bien due � l’interaction sp�cifique du ligand greff� avec sa cible cellulaire. Avant d’utiliser ces NPs comme vecteur th�rapeutique il est n�cessaire de conna�tre leur devenir intracellulaire. En effet, certains principes pharmaceutiques sont facilement d�gradables en conditions acides ce qui interdit leur lib�ration dans les organelles digestives de la cellule. De plus il est possible qu’une fraction des NPs internalis�es soit recycl�e � la surface de la cellule par exocytose. Ces deux facteurs limitent bien �videmment l’efficacit� du principe actif. Si au contraire, le vecteur est utilis� pour lib�rer un principe pharmaceutique sp�cifiquement dans les organelles

161

digestives de la cellule, il faudra garantir qu’une fraction cons�quente des NPs atteigne bien la cible intracellulaire sans �tre lib�r�e dans le cytosol ou recycl�e � l’ext�rieur de la cellule. Une �tude d’internalisation in vitro devrait permettre de mieux conna�tre la trajectoire intracellulaire suivie par les NPs. Par microscopie � fluorescence il est possible de suivre l’internalisation de NPs marqu�es a l’aide d’une sonde fluorescente. L’utilisation d’un second marqueur sp�cifique d’une organelle permettra de savoir si les deux esp�ces, NPs et organelles, sont colocalis�es et pour combien de temps. Dans le cas du ciblage des s�lectines, la voie d’internalisation que l’on privil�gie est la voie des clathrines. Il est donc aussi int�ressant de suivre la colocalisation des clathrines avec les NPs afin de pouvoir �tablir pr�cis�ment la trajectoire suivie par les NPs. Pour compl�ter l’�tude que nous avons r�alis�e, des tests in vivo permettraient de valider notre approche de formulation des NPs. Pour ce faire il serait n�cessaire avant tout de modifier l�g�rement la formulation du vecteur pour �viter son �limination rapide du flux sanguin apr�s injection. Pour cela, il est possible d’ajouter � la formulation du vecteur un troisi�me polym�re fonctionnalise avec un polym�re hydrophile comme le PEG. Ceci permettra de former une couronne protectrice � la surface de la NP capable d’�viter l’adsorption de prot�ines et d’opsonines responsables de l’�limination des NPs. La pr�sence de PEG � la surface de la NP peut aussi avoir certains d�savantages car le polym�re pourrait masquer le ligand pr�sent � la surface de la NP diminuant ainsi l’affinit� de la particule pour sa cible. Pour �viter cela, il est possible de greffer le ligand � l’extr�mit� d’un bras espaceur lui aussi hydrophile. De cette mani�re, l’exposition du ligand dans le milieu s�rique sera favoris�e et sa mobilit� facilitera sa capture par le r�cepteur membranaire cible. Pour �tudier l’effet de l’interaction entre cellules et substrat sur la capacit� d’internalisation des NPs, nous avons d�velopp� diff�rentes techniques permettant de mesurer l’adh�sion et l’�lasticit� des cellules adh�rentes sur un substrat de mica fonctionnalis�. Nous avons utilise l’appareil de forces de surface pour mesurer l’adh�sion et l’�lasticit� d’une monocouche de cellules. Cette nouvelle approche permet d’effectuer la mesure sur un grand nombre de cellules simultan�ment ce qui permet d’obtenir un mesure moyenne de leur propri�t�. Nos r�sultats ont montr� que la

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pr�sence de fibronectine sur le substrat augmente significativement l’�lasticit� et l’adh�sion cellulaire compar� au substrat fonctionnalis� avec la poly-L-lysine. Cette augmentation de l’�lasticit� cellulaire est due � la polym�risation de l’actine qui est d�clench�e par l’interaction entre la fibronectine et l’int�grine. Les tests d’internalisation in vitro ont montr� que la capacit� de p�n�tration des NPs d�pendait fortement du substrat sur lequel �taient d�pos�es les cellules. Les r�sultats indiquent qu’il existe une corr�lation entre les propri�t�s �lastiques cellulaire et l’internalisation des NPs. L’�lasticit� cellulaire �tant due en partie � la pr�sence de filament d’actine corticale, le substrat de fibronectine favorise la formation et la densification du r�seau d’actine. Ceci � pour cause de stabiliser les sites d’internalisation et notamment les puits mantel�s de clathrine. La stabilisation des puits mantel�s favorise l’internalisation des NPs de PLA d�j� connue pour p�n�trer dans les cellules macrophagiques par cette voie. Afin d’explorer plus profond�ment la relation entre cytosquelette et internalisation des vecteurs nanoparticulaire, il serait n�cessaire de reproduire les r�sultats de notre �tude sur d’autres lign�es cellulaires afin de pouvoir g�n�raliser les r�sultats que nous avons expos�. De plus il serait important de d�terminer si les voies d’internalisation des NPs peuvent �tre modifi�es par le contr�le des propri�t�s �lastiques des cellules. Pour ce faire, une �tude d’inhibition s�lective des voies d’internalisation r�alis�e sur des cellules dont les propri�t�s m�caniques seraient connues devrait permettre d’identifier les relations entre les voies d’entr�e des NPs et l’�lasticit� membranaire. Enfin, l’effet de l’�lasticit� des NPs sur leur capacit� de p�n�tration a �t� �tudi� sur des cellules macrophagiques de souris. Dans un intervalle d’�lasticit� allant de quelques dizaines kPa � quelques centaines de kPa, nous avons observ� un changement dans les m�canismes d’entr�e des NPs dans les macrophages. Les NPs tr�s molles entrent pr�f�rentiellement par macropinocytose alors que les NPs tr�s �lastiques sont internalis�es par la voie des clathrines. Entre ces deux situations, les NPs ayant un module �lastique interm�diaire p�n�trent dans les cellules en utilisant plusieurs voies d’internalisation dont la voie cav�olaire. Ces diff�rences peuvent �tre expliqu�es en consid�rant les propri�t�s �lasto-dynamiques des NPs et de la membrane

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cellulaire. Une fois internalis�es, les NPs suivent une trajectoire endosome-lysosome qui semble �tre ind�pendante des microtubules. Les NPs s’accumulent dans les lysosomes avec diff�rentes de cin�tique principalement li�es aux diff�rentes de voies d’entr�es. Afin de v�rifier si ces observations sont g�n�ralisables, il est propos� de reproduire les tests que nous avons effectu� sur d’autres lign�es cellulaires. Les particules d’hydrogel pr�sentent certains avantages quand � leur possibilit� de fonctionnalisation. Comme nous l’avons montr�, il est possible de leur greffer des marqueurs fluorescent mais l’on pourrait utiliser la m�me approche pour greffer une mol�cules bioactives comme un ligand sp�cifique d’une r�cepteur ou m�me une mol�cule de PEG afin de conf�rer � la NP des propri�t�s furtives. De plus la formulation de NPs peut �tre modifi�e tr�s simplement pour leur conf�rer une certaine sensibilit� � un stimuli physicochimique comme le pH. Cette sensibilit� peut se traduire par une contraction de son volume interne apr�s acidification du milieu (comme c’est le cas lors d’une passage des endosomes aux lysosomes)

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